青虾几丁质酶基因全长cDNA序列的克隆及时空表达分析

摘要

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)，俗称河虾，是我国重要的淡水养殖品种。2012年的养殖产量达到了237，431吨，年产值超过150亿。青虾的生长、发育以及交配繁殖都与蜕壳（蜕皮）紧密相关。几丁质酶是在甲壳动物蜕壳过程中起着重要的作用的几种酶之一，与β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶联合作用将几丁质聚合物水解成为几丁质单体，从而使旧的外壳脱落。除在蜕壳过程中发挥作用外，几丁质酶还具有多种生物学作用，如食物消化、围食膜的降解、免疫反应等。鉴于几丁质酶基因在甲壳动物中的作用，且在青虾中至今没有研究报道。因此，本文拟克隆出青虾的几丁质酶家族基因，并将它们进行系统分类和命名。通过研究它们的分子特征、组织分布、胚后发育以及在蜕壳周期过程中的时空表达模式，结合不同温度下各几丁质酶基因的表达情况，进而推断出这些基因可能的生物学功能。
　　本文从本实验室构建的青虾精巢文库中筛选到28条几丁质酶基因的EST序列，将这些EST序列拼接后获得5个几丁质酶基因的中间序列，此外还通过同源克隆的方法获得1个几丁质酶基因的中间序列。采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplification ofcDNA ends，RACE)技术从青虾中克隆出这6个几丁质酶基因(MnCht1A、MnCht1B、MnCht3A、MnCht3B、MnCht3C和MnCht4)的全长cDNA序列，它们的cDNA序列全长分别为1554、1529、2459、1359、1547和1941bp，分别编码408、410、380、389、480、618个氨基酸残基。根据已有的报道，甲壳动物具有6类(Group1～6)几丁质酶基因。本文中的6个几丁质酶基因可以分成三类(Group1、Group3和Group4)，Group1中具有MnCht1A和MnCht1B两个基因，且这两个基因编码的氨基酸序列都缺少S/T富集的连接区和几丁质结合结构域;Group3中具有MnCht3A、MnCht3B和MnCht3C三个基因，只有MnCht3C编码的氨基酸序列具有完整的几丁质酶结构，MnCht3A和MnCht3B编码的氨基酸序列同样缺少S/T富集的连接区和几丁质结合结构域;Group4中只有MnCht4一个基因，编码的氨基酸序列具有完整的几丁质酶结构，且具有两个几丁质结合结构域。
　　6个几丁质酶基因在成体青虾10个组织（肌肉、表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、脑、腹神经节、肠道、眼柄、鳃）中的分布不尽相同，MnCht1A和MnCht1B这两个Group1几丁质酶基因主要分布在精巢、表皮、肝胰腺和肠组织中。Group3中的MnCht1A、MnCht3B、MnCht3C这3个基因的组织分布具有较大的差异，仅有的共同特征是这3个基因都在肝胰腺和肠道这2个组织中表达，而且肠道中的表达量要远远高于肝胰腺，这一表达特征与Group1中的两个基因正好相反。MnCht3A在精巢、肝胰腺和肠道这3个组织中表达;MnCht3B在表皮、精巢、肝胰腺、肠道和眼柄这5个组织中表达，与MnCht1A的组织分布很相似;MnCht3C仅在肝胰腺和肠道这两个组织中表达。MnCht4具有较为广泛的组织分布，除了脑、腹神经节和肠道这3个组织外，其余的7个组织（肌肉、表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、眼柄、鳃）都检测到了MnCht4的表达。
　　胚后发育各时期(L1、L4、L7、L10、L13、PL1、PL5、PL10、PL15和PL20)的定量分析表明所有的基因在幼体期都没有表达，直到变态发育完成后才开始表达，且MnCht1A、MnCht1B、MnCht3B和MnCht4四个几丁质酶基因在PL1、PL5、PL10、PL15、PL20这5个取样点的表达量呈现出“低—高—低—高—低”的波动性变化规律。然而，MnCht3A和MnCht3C却没有出现这样的变化规律。在整个蜕壳周期的各时期(A-B、C、D、E)，MnCht1A、MnCht1B、MnCht3B和MnCht4在表皮中的表达量变化十分明显，其中蜕壳期的表达量最高，随着蜕壳的完成其表达量也相应地下降直至间期无表达水平被检测出来，然后随着新一轮蜕壳的开始，这四个基因的表达量又逐渐升高，虽然MnCht4在蜕壳周期中与其余的3个基因具有相同的表达规律。，但其表达水平却远远低于它们。在整个蜕壳周期的表皮组织中都未检测到MnCht3A和MnCht3C的表达。
　　温度是影响甲壳动物蜕壳的重要因素，当甲壳动物生活所处的环境温度突然发生变化（温度的骤升和骤降），常会引起甲壳动物的蜕壳，温度变化幅度过大还会造成死亡。本研究以25℃为对照组（正常组），将生活于25℃转至升温组(30℃)和降温组(20℃)中，并对正常组、升温组和降温组中各几丁质酶基因的表达情况进行定量分析，结果表明MnCht1B、MnCht3B和MnCht4三个基因的表达量都有显著性的升高，且升温组这三个基因的表达量较高于降温组。然而，与正常组相比，MnCht1A在升温组和降温组都没有明显的变化。MnCht3A和MnCht3C在升温组、降温组和正常组的表皮组织中都没有表达。
　　综上所述，由于MnCht3A和MnCht3C在各个实验所取的表皮组织中都没有检测到表达，因此推测MnCht3A和MnCht3C作为消化酶参与消化反应过程。而MnCht1A、MnCht1B、MnCht3B和MnCht4在成体青虾的蜕壳过程中发挥重要的作用，其中MnCht1B发挥了主要作用。本研究首次在青虾中克隆出一系列几丁质酶基因，并对其组织分布、胚后发育以及在蜕壳周期过程中的时空表达模式进行了系统的研究。为青虾几丁质酶基因的进一步研究以及蜕壳机制的研究提供重要的参考。同时，也为其他甲壳动物的相关研究提供参考。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

第一节 几丁质酶及甲壳动物蜕壳相关研究概况

1 几丁质

2 几丁质酶及其分类

3 甲壳动物蜕壳及其调控的研究

第二节 几丁质酶基因的研究进展

1 几丁质酶基因研究概况

2 几丁质酶基因编码的氨基酸序列结构特征

3 几丁质酶基因表达的调控

4 几丁质酶的功能研究

第三节 本研究的目的与意义

第二章 青虾六个几丁质酶基因的克隆及序列分析

1 实验材料

1．1 实验虾

1．2 试剂

1．3 仪器

2 实验方法

2．1 青虾总RNA的提取

2．2 cDNA合成

2．3 青虾几丁质酶基因中间片段的获得及验证

2．4 RACE快速扩增

2．5 PCR产物的克隆

2．6 序列拼接

2．7 青虾六个几丁质酶基因全长cDNA完整性验证

2．8 生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 青虾六个几丁质酶基因中间片段序列

3．2 青虾六个几丁质酶基因3'端的分离

3．3 青虾六个几丁质酶基因5’端的分离

3．4 青虾六个几丁质酶基因全长cDNA序列结构特征

3．5 基因命名和系统进化分析

3．6 青虾六个几丁质酶基因编码的氨基酸序列比对

3．7 三级结构预测

3．8 青虾六个几丁质酶氨基酸序列一致性比较

4 讨论

第三章 青虾六个几丁质酶基因的时空表达特征以及温度变化对表达的影响

1 实验材料

1．1 实验虾

1．2 主要试剂

1．3 仪器

2 实验方法

2．1 青虾胚后发育样品的采集

2．2 青虾组织表达样品的采集

2．3 青虾蜕壳周期样品的采集

2．4 不同温度样品的采集

2．5 青虾六个几丁质酶基因时空表达的实时荧光定量PCR分析

3 结果

3．1 青虾各样本总RNA的检测

3．2 荧光定量引物的验证

3．3 青虾六个几丁质酶基因在成体不同组织中的表达

3．4 青虾六个几丁质酶基因在胚后发育期的表达

3．5 青虾六个几丁质酶基因在蜕壳周期的表达

3．5 青虾六个几丁质酶基因在不同温度下的表达

4 讨论

4．1 青虾六个几丁质酶基因在成体不同组织的表达差异

4．2 青虾六个几丁质酶基因在不同发育时期的表达差异

4．3 青虾六个几丁质酶基因在蜕壳周期和温度下的表达规律

全文结论

参考文献

附录

致谢

已发表或已接收的论文