猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的遗传变异分析及间接ELISA检测方法的建立与应用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病.我国1996年才报道有PRRS流行，目前流行的范围日益扩大，对养猪业构成了严重威胁.快速、特异且敏感的诊断方法对本病的控制已成为迫切需要.PRRSV为正链的单股RNA病毒，基因组长15kb，含有8个开放阅读框.核衣壳蛋白N蛋白由ORF7基因编码，该蛋白在全病毒中含量最高，免疫原性最强，是病毒感染后最早诱导产生特异性非中和抗体的蛋白.因此，PRRSV N蛋白在病毒的早期诊断和致病免疫机理研究中具有重要意义.本研究对GenBank中登录的PRRSV中国大陆分离株的N蛋白进行了遗传变异分析，在此基础上，利用原核表达系统对我国优势流行毒株ORF7基因进行了高效可溶性表达，并用重组的N蛋白作为抗原，建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.主要研究内容包括:
　　 1 PRRSV中国大陆分离株的N蛋白的遗传变异分析
　　 选取GenBank中登录的PRRSV中国大陆分离株的N蛋白进行了氨基酸序列分析和进化树分析，结果表明中国大陆所有已登录的256株PRRSV分离株分为欧洲型和美洲型两个基因型，大多数为美洲型毒株，其又可以分为4个不同的亚型;序列比对分析表明，各亚型毒株的氨基酸位点发生了特征性的突变，且N蛋白中的抗原表位也存在氨基酸的置换，表明我国PRRSVN蛋白存在遗传多样性的特点.
　　 2我国优势流行毒株N蛋白的原核表达
　　 针对我国优势流行毒株ORF7基因序列，设计了特异性引物，对其进行扩增与克隆，构建重组表达质粒pET-28a-N.将重组质粒pET-28a-N导入大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达，结果表达出大小约为22kDa的重组蛋白.经Western-Blot分析，该表达产物能与PRRSV阳性血清反应，具有良好的反应原性，说明PRRSV N蛋白在原核系统中获得了有效表达.
　　 3 PRRSV N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用
　　 用纯化的N蛋白作包被抗原，通过优化反应条件，建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.实验结果表明:抗原的最适包被浓度为2.23μg/mL，血清最适稀释度为1∶200，最佳血清反应时间确定为37℃1h，二抗反应时间确定为37℃1h，底物显色液的最佳反应时间为5 min，阴阳性临界值为0.395.所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和重复性.利用所建立的N-ELISA方法与IDEXX-ELISA检测试剂盒对来自不同地区的192份临床血清样品进行比较，结果显示所建立的间接ELISA方法与IDEXX-ELISA检测试剂盒有较好的符合性，且具有较高的特异性和敏感性.

目录

声明

摘要

缩略词表

文献综述

1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的发现与命名

2 PRRSV的分类地位

3 PRRSV的一般特性

3．1 PRRSV的形态特征

3．2 PRRSV的理化特性

4 PRRSV的分子生物学特征

4．1 PRRSV的基因组组成

4．2 PRRSV基因编码的蛋白质及其功能

4．3 PRRSV的基因组变异和RNA重组

4．4 PRRSV的抗原性变异

4．5 PRRSV的毒力变异

5 PRRSV的流行病学特点

6 PRRSV的致病机制

7 PRRSV的诊断方法

7．1 临床诊断

7．2 病毒分离法

7．3 血清学方法

7．4 分子生物学诊断

参考文献

第一章 中国大陆PRRSV N蛋白的遗传变异分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PRRSV中国大陆分离株N蛋白序列的统计

2．2 PRRSV中国大陆分离株N蛋白的进化分析

2．3 PRRSV中国大陆分离株N氨基酸序列的比对分析

3 讨论

参考文献

第二章 我国优势流行毒株N蛋白基因的表达及鉴定

1 材料与方法

1．1 质粒、菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 PRRSV RNA的提取

2．2 PRRSV-N基因RT-RCR扩增

2．3 目的片段的回收纯化

2．4 目的片段的克隆

2．5 重组质粒DNA的提取

2．6 重组质粒的鉴定

2．7 重组质粒的测序鉴定

2．8 原核表达载体pET-28a(+)／ORF7的构建

2．9 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定

2．10 重组质粒pET-28a-N在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

3 结果

3．1 N基因的RT-PCR扩增

3．2 克隆载体pMD18-T-N酶切鉴定

3．3 重组质粒pET-28a(+)-N的酶切鉴定

3．4 表达产物的SDS-PAGE

3．5 重组蛋白的纯化结果

3．6 重组蛋白的Western blotting分析

4 讨论

参考文献

第三章 PRRSV N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

1 材料与方法

1．1 质粒、菌株、血清

1．2 主要试剂和仪器

1．3 方法

2 结果

2．1 抗原抗体最佳稀释度的确定

2．2 抗原最佳包被条件的确定

2．3 最佳封闭条件的确定

2．4 阴阳性临界值的确定

2．5 特异性实验

2．6 重复性试验

2．7 符合性试验

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢