大豆E3泛素连接酶基因GmARI的克隆与功能验证

摘要

大豆是世界上重要的油料作物，也是植物蛋白的主要来源之一。世界上酸性土壤占可耕土地面积的40％，占非可耕土地面积的70％，在我国酸性土壤占全国土地面积的21％，酸性土壤中的铝毒是我国南方地区影响大豆产量的重要因素，大豆耐酸铝的机理尚不十分清楚，限制了分子育种工作的开展，因此，发掘大豆耐铝的基因资源，研究耐铝机理将促进大豆耐铝的种质培育和改良。前人在大豆的耐铝种质资源筛选、耐铝相关QTL定位等方面已经做了大量工作，为培育耐铝大豆新品种和耐铝基因的发掘奠定了良好的基础，随着生物技术的发展，利用基因工程原理培育高产、优质、抗病、耐逆的大豆新品种受到越来越多研究者的关注.大豆遗传转化是基因功能研究以及分子育种应用的基础，但大豆的遗传转化中还存在诸多困难，建立成熟稳定的遗传转化体系是大豆基因工程育种的关键所在。
　　 本研究在实验室前期定位基础上结合大豆基因组信息和基因的功能预测选择耐铝候选基因，并对候选基因进行克隆和功能验证;同时，在前人研究的基础上选用再生能力较好的7份大豆材料进行丛生芽率比较试验，并对转化体系进行改进。主要结果如下:
　　 1.根据耐铝毒QTL定位和候选基因功能预测的E3连接酶基因序列，克隆得到两个基因，预测其含有ARIADNE结构域，因此分别命名为GmARI(Glycine maxARIADNE)1，GmARI2.
　　 序列分析显示GmARI1基因全长为2042 bp; GmARI2全长2022 bp，ORF均为1758bp，编码586个氨基酸。其中GmARI1基因位于11号染色体上耐铝性状QTL定位的区段（GMKF046-Sat_128）内，而GmARI2基因位于12号染色体上。两个基因均含有15个外显子和14个内含子，这两个基因编码的蛋白均属于RBR蛋白亚家族，在223-266氨基酸残基位点有典型的IBR(C6HC)结构域，两边分别含有一个RING结构域。目前，RBR结构域在植物中的研究较少，在大豆中尚未有相关报道，组织表达分析显示这两个基因在根、茎、叶、茎尖生长点、花和种子中均有表达。亚细胞定位结果表明GmARI1和GmARI2蛋白均定位于细胞核内，推测两个基因可能是在核中参与蛋白泛素修饰途径。Real-time PCR的结果显示，GmARI1和GmARI2两个基因在Al3+，Na+，JA，Man，IAA，ACC，SA和GA3处理下的表达量均有所增加，根中的变化趋势比叶子中的明显，这与前人研究中铝毒对植物的危害主要表现在根上这一说法一致，且GmARI1基因在各处理下的表达量都比GmAR2要高。推测GmARI1基因很可能参与耐铝相关途径。用15μM Al3+(pH4.3)处理转GmARI1和GmARI2基因的拟南芥植株，转GmARI1基因的植株根系显著长于野生型，结合Real-time PCR结果，推测GmARI1基因的过量表达能够提高植物的耐铝性。
　　 2.在转基因大豆方法研究中，对不同材料丛生芽率的比较发现大粒黄和Williams的丛生芽率较高，且综合表现较好。以大粒黄为受体材料进行遗传转化，得到16株抗卡那霉素（Kan）的转基因苗，涂抹实验和PCR检测结果为假阳性，说明我们所使用的转化体系不完善，转化效率较低，推测得到的抗性苗是由于大豆自身对Kan具有一定的抗性，后期对种子的萌发和外植体处理进行改进，不仅节省了时间，减少了处理过的外植体在空气中暴露的时间，提高了外植体伤口被农杆菌侵染的机会，以提高转化效率，而且改进后的体系结合GUS染色方法，能检测每批处理的转化效率。

目录

声明

摘要

缩略词表及英汉对照

第一章 文献综述

1 植物耐铝的相关研究进展

1．1 我国土壤铝毒现状

1．2 铝毒对植物的危害

1．3 植物对铝毒的抗性机制

1．4 大豆耐铝的研究进展

2 泛素E3连接酶相关基因的研究进展

2．1 泛素化反应机制

2．2 泛素E3连接酶

2．3 RING finger的结构和功能

2．4 RBR结构域的研究进展

3 大豆遗传转化的研究进展

3．1 大豆再生体系的研究进展

3．2 大豆遗传转化的方法的研究进展

3．3 大豆遗传转化的主要障碍及解决办法

3．4 大豆遗传转化的展望

4 立题依据和研究目标

4．1 立题依据和背景

4．2 研究目的和意义

4．3 研究目标与内容

第二章 大豆GmARI1和GmARI2基因的克隆及功能研究

1 实验材料

1．1 植物材料

1．2 菌株及质粒

1．3 试剂

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 大豆基因GmARI1和GmARI2的克隆

2．2 GmARI1和GmARI2基因的生物信息学分析

2．3 载体的构建

2．4 组织表达分析

2．5 亚细胞定位

2．6 GmARI1和GmARI2基因的荧光定量分析

2．7 GmARI1和GmARI2基因功能的研究

3 结果与分析

3．1 大豆耐铝基因GmARI1和GmARI2的克隆

3．2 GmARI1和GmARI2基因载体的构建

3．3 GmARI1和GmARI2基因组织表达

3．4 GmARI1和GmARI2基因的亚细胞定位

3．5 GmARI1和GmARI2基因的荧光定量分析

3．6 GmARI1和GmARI2基因功能的研究

4 讨论

第三章 大豆遗传转化体系的研究

1 材料与试剂

1．1 试验材料

1．2 供试载体及菌液

1．3 供试试剂及主要仪器

2 实验方法

2．1 大豆的遗传转化

2．2 品种比较试验

2．3 转化体系的改进

3 结果与分析

3．1 大豆的遗传转化

3．2 不同品种的比较试验

3．3 GUS染色结果

4 讨论

全文结论

本研究的创新之处

附录

参考文献

致谢