酿酒酵母中小G蛋白Ypt1对Ypt6在细胞外吐和细胞自噬过程中功能互补的研究

摘要

Ypt6和Ypt1属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)小G蛋白Rab家族的两个成员，和其它小G蛋白一样，也需在GTP结合态和GDP结合态之间循环，并利用其处于GTP结合态的形式与下游效应物结合发挥功能。Ypt6从GTP结合态向GDP结合态转变的过程中需要GEF(Guanine nucleotide exchange factors)复合物Rgp1-Ric1的激活。YPT6是酿酒酵母中的非必需基因，它的缺失不会造成细胞死亡，但其生长表现出对高温敏感。RGP1或RIC1的缺失会导致菌株生长对高温敏感，并且可以通过过量表达YPT6来抑制这一温敏感表型。生理生化实验表明Ypt6在调控囊泡运输的分泌途径:从ER到Golgi，和/或者cis-Golgi到medial-Golgi的早期阶段起作用。YPT6和相关的RGP1或RIC1突变菌株中一些分泌性的蛋白酶如蔗糖酶(Invertase)，羧肽酶Y（Carboxypeptidase Y，CPY）的正常成熟和分泌受阻，其中CPY的积累会形成独特的ER或cis-Golgi形态，并且YPT6的缺失会导致少量的CPY错分泌到细胞表面。此外，Ypt6也被指出与细胞自噬有关，Ypt6相关基因的缺失会影响细胞自噬中的选择性Cvt（Cytoplasm to vacuole targeting）途径，但是不会影响非选择性自噬的正常进行。
　　 有报道指出，在ypt6ts菌株中过量表达Ypt1可以恢复其在高温下的生长，但具体的作用机制尚不清楚。Ypt1是酿酒酵母中第一个被鉴定出来的Rab小G蛋白，分布于内质网和高尔基体上，参与囊泡从内质网向高尔基体的运输过程，另外直接或间接参与了微管组织的形成和功能的发挥，参与囊泡运输的融合过程。生长的缺陷与多种生理过程的缺陷有关，而Ypt1可能在一定程度上恢复了ypt6ts菌株中这些有缺陷的生理过程，并对Ypt6的GEF亚基突变菌株，RGP1或RIC1敲除菌株，具有类似的恢复作用。
　　 本研究主要探讨在细胞外吐和细胞自噬两种生理过程中Ypt6及相关蛋白Rgp1和Ric1突变或缺失所导致的功能缺陷，及Ypt1对这些缺陷的功能互补。实验结果显示，Ypt6或其GEF亚基(Rgp1、Ric1)的缺失在表现出生长对高温敏感的同时导致GFP-Snc1所标记的细胞外吐途径运输受阻，而过量表达Ypt1可以抑制这些突变菌株的高温敏感性并恢复GFP-Snc1在内质网和质膜之间的运输，进而帮助这些突变菌株中细胞外吐过程的正常进行。通过FM4-64染色发现，过量表达Ypt1对这些突变菌株中液泡形态的恢复也有帮助作用。另外，在饥饿条件下，YPT6或RGP1、RIC1突变的菌株中自噬存在缺陷，主要体现在用于跟踪自噬变化的GFP-Atg8在突变体中降解滞后。同样，在ypt6ts、ric1△、rgp1△或者ric1△rgp1△突变菌株中过量表达Ypt1可以恢复这些菌株的生长并抑制这些突变菌株的自噬缺陷，帮助GFP-Atg8送往液泡中进行降解。在这些不同的突变体中，可同时用于跟踪选择性Cvt途径和非选择性自噬的另一个蛋白分子Ape1，无论在营养丰富还是营养缺乏的条件下，Ape1的成熟均受到了影响，而过量表达Ypt1可以抑制这些突变菌株中Cvt运输途径的缺陷，帮助前体状态的Ape1运往液泡中成熟。本研究还发现虽然过量表达Ypt1能帮助ypt6ts、ric1△、rgp1△或者ric1△rgp1△突变菌株完全恢复在高温下的生长，但却不能恢复Ypt6在突变菌株细胞内的正确定位，说明Ypt1不是通过恢复Ypt6的功能起作用，而是在功能上与Ypt6有一定的冗余。
　　 本研究的实验结果显示Ypt1对Ypt6相关突变体中两种不同的生理过程（细胞外吐和细胞自噬）均能进行互补，暗示着细胞内的细胞外吐（囊泡运输）和细胞自噬之间可能存在密切的联系。而酿酒酵母小G蛋白Ypt1对Ypt6相关突变体中各种缺陷的功能互补，说明Ypt1可以行使Ypt6的部分功能，促进细胞内的囊泡运输与细胞自噬等生理过程，从而维持正常的生理代谢，恢复温敏感突变菌株的生长，从一定程度上阐释了Ypt1恢复ypt6ts温敏感性的作用机理。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

一、真核生物中小G蛋白的介绍

1．小G蛋白的分类

2．Rab小G蛋白

3．酿酒酵母中Ypt类Rab小G蛋白

二、Rab小G蛋白在细胞囊泡运输过程中的作用

1．囊泡运输

2．Ypt／Rab类小G蛋白参与囊泡运输的情况

三、Rab小G蛋白在细胞自噬过程中的作用

1．细胞自噬

2．Ypt／Rab类小G蛋白参与细胞自噬的情况

四、研究目的

第二章 酿酒酵母中小G蛋白Ypt1对Ypt6在细胞外吐过程中的功能互补研究

1．材料与方法

1．1 酵母菌株和质粒

1．2 培养基

1．3 抗生素及使用浓度

1．4 试剂

1．5 仪器

1．6 实验方法和技术

2．结果与分析

2．1 结果

2．2 讨论

3．小结

第三章 酿酒酵母小G蛋白Ypt1对Ypt6在细胞自噬过程中的功能互补研究

1．材料与方法

1．1 酵母菌株和质粒(本实验室保藏)

1．2 培养基

1．3 抗生素及使用浓度

1．4 试剂

1．5 仪器

1．6 实验技术和方法

2．结果与讨论

2．1 结果

2．2 讨论

3 小结

第四章 酿酒酵母中小G蛋白Ypt1对Ypt6在细胞内定位的影响

1．材料与方法

1．1 酵母菌株和质粒(本实验室保藏)

1．2 培养基

1．3 抗生素及使用浓度

1．4 试剂

1．5 仪器

1．6 实验技术和方法

2．结果与讨论

2．1 结果

2．2 讨论

3．小结

全文总结

本论文创新之处

参考文献

附录一 培养基、常备试剂与缓冲液

附录二 克隆pRS425-YPT6#16序列比对结果

致谢