水稻条纹病毒NSvc2基因产物的原核表达、抗体制备及特性分析

摘要

由灰飞虱传播水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻条纹叶枯病是目前水稻生产上的重要病毒病，该病在我国的分布极为广泛，给水稻生产带来巨大的损失。目前，灰飞虱传播RSV的机制还不清楚，研究灰飞虱传毒机制对于切断病毒的传播、控制该病毒病害具有重要意义。由于RSV与TSWV(Tomato Spotted Wilt Virus，TSWV)的基因组结构相似，并且RSV编码的NSvc2蛋白与TSWV的膜糖蛋白（参与蓟马传播的决定因子）相对应，因此，作者推测NSvc2很可能是RSV参与介体灰飞虱传播的决定因子。
　　 为了弄清NSvc2的功能，本研究首先分析该基因的拓扑结构，采用RT-PCR从感染RSV的水稻中克隆获得基因R-GN、R-GC、 R-GNS和R-GCS。借助原核表达载体构建了R-GN、R-GC、R-GNS和R-GCS的融合蛋白原核表达重组子，转化大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21(DE3)并诱导表达，SDS-PAGE检测其表达产物与预期结果大小一致。进一步制备了R-GNS和R-GCS的抗血清，Western-blot结果显示，所制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。然后利用获得的抗血清检测了NSvc2蛋白在RSV感病水稻和带毒灰飞虱中的表达情况，结果发现，NSvc2蛋白在水稻和灰飞虱体内以2种不同的形式存在，在水稻中NSvc2蛋白存在切割现象，被切割成2个蛋白R-GN(40kDa)和R-GC（53或56 kDa），在灰飞虱体内NSvc2的产物不再被切割，而以94 kDa的完整蛋白形式存在。本研究应用酵母双杂交技术分析了RSV-CP与NSvc2基因产物R-GN、R-GC之间的互作关系，结果显示，R-GN、R-GC蛋白均与RSV-CP存在互作关系，而R-GN和R-GC之间不存在互作关系，这为证明NSvc2是RSV参与灰飞虱传播的决定因子这一推测打下了基础。
　　 此外，本论文还以实验室多代筛选获得的高带毒(RSV)灰飞虱群体为材料参与构建了酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明:文库库容量为3.68×107 cfu，扩增文库滴度为2.62×1010 cfu/mL，文库重组率大于95％，cDNA插入片段平均长度＞1 kb，达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 水稻条纹病毒的研究概况

1．1 寄主范围、症状及分布

1．2 病毒粒子分类地位及性状

1．3 水稻条纹病毒的分子生物学研究概况

2 植物病毒介体昆虫传播机制的研究进展

2．1 非循回型植物病毒介体昆虫传播机制

2．2 循回型植物病毒介体昆虫传播机制

3 膜糖蛋白在介体传播病毒过程中的作用

第二部分 研究内容

第一章 水稻条纹病毒NSvc2基因产物的原核表达、抗体制备及检测

1．1 材料与方法

1．2 结果与分析

1．3 小结与讨论

第二章 RSV CP与RSV-GN、RSV-GC的互作研究

2．1 材料与方法

2．2 结果与分析

2．3 小结与讨论

第三章 灰飞虱高带毒(RSV)群体酵母双杂交cDNA文库的构建

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．3 小结与讨论

参考文献

附录Ⅰ 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录Ⅱ 常用缓冲液及试剂配方

攻读硕士期间发表的文章

致谢