转胱硫醚-γ合成酶基因高蛋氨酸大豆对土壤酶活性与土壤细菌群落结构的影响

摘要

相对于传统大豆，转基因大豆的核酸组成发生了一定的变化，其外源基因表达的产物可能影响转基因大豆的生理生化特征，进而产生一定环境影响。转基因大豆的环境影响评价是其大面积应用和推广的前提，其中对土壤酶活性和土壤微生物的影响是环境评价的重要内容。
　　 本文采用土壤酶活测定、微生物平板计数方法，结合DGGE-cloning技术及PCR-RFLP技术，以非转基因受体大豆(ZGDD)为对照，评估转胱硫醚-γ-合成酶基因高蛋氨酸大豆(CGS)在苗期、花期、鼓粒期和成熟期对根际土壤酶活、土壤细菌群落结构及氨氧化细菌群落结构的影响。1.以传统的土壤酶活测定方法对大豆四个生长时期中大豆根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活进行测定。2.通过传统微生物平板计数方法完成了大豆各生长时期根际土壤中真菌、细菌和放线菌的计数;并以直接法从根际土壤中提取总DNA，利用细菌通用引物扩增16S rDNA的V3区，然后以DGGE-cloning技术分析大豆各生长时期根际土壤样品中的细菌群落结构。3.以特异性引物扩增大豆花期、鼓粒期和成熟期根际土壤中氨氧化细菌amoA基因，构建amoA基因克隆文库，通过RFLP技术分析CGS在大豆各生长时期中对土壤样品中的氨氧化细菌的群落结构的影响。
　　 研究结果显示，1与对照ZGDD相比，转基因大豆(CGS)根际土壤脲酶酶活在大豆四个生长时期中呈现先降后升的趋势，根际土壤转化酶和过氧化氢酶酶活则相对稳定;同一大豆生长时期内，与ZGDD相比三种根际土壤酶活均无显著性差异。2.a）与对照ZGDD相比，转基因大豆(CGS)在大豆四个生长时期里其根际土壤真菌、细菌和放线菌的生物量均无显著差异，而各微生物类群生物量受大豆生长时期的影响较为明显，大豆根际土壤中，真菌和细菌数量呈现先增后减的趋势，放线菌则不受影响。b）将转基因大豆(CGS)与ZGDD在各生长时期的根际土壤细菌DGGE图谱进行对比分析，得知种植不同大豆的根际土壤细菌种类均较为丰富，其根际土壤细菌群落结构受大豆生长时期的影响较为明显，在同一生长时期内，CGS与ZGDD的根际土壤细菌群落高度相似。c）大豆不同生长期内的根际土壤细菌群落多样性指数（香农指数）与所处的生长时期密切相关，在苗期、花期、鼓粒期持续下降，成熟期则显著升;在同一生长时期，与ZGDD相比，CGS根际土壤细菌群落的香农指数略有差异，但并不显著。通过构建大豆根际土壤细菌群落系统发育树，发现不同生长时期内的根际土壤样品中，优势细菌菌群都是拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌和酸杆菌门(Acidobacteria)细菌。3.a)本研究构建了花期、鼓粒期和成熟期共9个土壤AOB细菌amoA基因克隆文库，共有360个克隆子，包括30种OTUs，库容值的变化范围是72.5-87.5％。b）克隆文库中amoA基因经酶切后PAGE胶电泳分型研究表明，与ZGDD相比，CGS对根际土壤氨氧化细菌群落结构的影响并不明显，各时期的主要优势AOB类群并未发生改变。c)从香农指数来看，鼓粒期和成熟期香农指数明显高于花期，同一时期内，转基因大豆要略高于非转基因受体大豆，但未达到显著水平，可见，生长时期可能对根际土壤AOB细菌群落结构产生一定影响。从均匀度指数来看，克隆文库的均匀度无显著差异，CGS的种植并没有导致土壤AOB群落结构的单一化。d）通过构建大豆根际土壤氨氧化细菌amoA基因的系统发育树，发现除了部分序列与未培养氨氧化菌同源性较高外，其余的AOB种群主要集中于亚硝化螺菌属(Nitrosospira)。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 转基因大豆的发展概况

1．1 转基因大豆的发展

1．2 胱硫醚-γ-合成酶基因及高蛋氨酸大豆简介

2 转基因作物对土壤生态系统的影响

2．1 转基因作物对土壤酶活性的影响

2．2 转基因作物对土壤微生物多样性的影响

2．3 转基因作物外源基因逃逸对环境产生的威胁

3 土壤微生物多样性的研究方法进展

3．1 基于生物或化学的研究方法

3．2 基于现代分子生物学的研究方法

参考文献

第二章 转基因大豆(CGS)对土壤酶活性的影响

1 材料与方法

1．1 试验区概况及试样栽培方法

1．2 试验材料处理及土样采集

1．3 脲酶活性测定方法(urease，水解酶)

1．4 蔗糖酶活性测定(invertase，水解酶)

1．5 过氧化氢酶活测定(catalase，氧化酶)

2 结果与分析

2．1 土壤脲酶酶活性

2．2 土壤蔗糖酶酶活

2．3 土壤过氧化氢酶酶活

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 转基因大豆(CGS)对根际土壤细菌多样性的影响

1 材料与方法

1．1 土壤微生物计数

1．2 菌株、试剂与仪器

1．3 土壤总DNA提取与纯化

1．4 土壤细菌多样性的PCR-DGGE分析

2 结果与分析

2．1 土壤微生物计数

2．2 土壤总DNA的提取与纯化

2．3 基于DGGE-cloning技术分析CGS对根际土壤细菌多样性的影响

2．4 大豆不同生长时期Shannon指数对比

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 转基因大豆CGS对土壤氨氧化细菌amoA功能基因多样性的影响分析

1 材料与方法

1．1 基因amoA的PCR扩增

1．2 感受态细胞的制备

1．3 PCR产物的TA克隆

1．4 酶联产物的转化

1．5 文库的构建与保存

1．6 amoA基因的RFLP分析

2 结果与分析

2．1 细菌amoA基因的扩增

2．2 氨氧化细菌amoA基因多样性分析比较

2．3 氨氧化细菌amoA基因的系统发育分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文总结

创新点

附录 文中所用的培养基和试剂配方

一、培养基

二、试剂

致谢