高赖氨酸转基因玉米(SB401基因)对土壤酶活性及土壤细菌群落结构的影响

摘要

玉米是世界三大谷类作物之一，也是我国的第一大作物种类，不仅是重要的粮食来源，也是重要的饲料和工业原料。但是传统玉品种的营养品质较差，缺乏必需的氨基酸，如赖氨酸、色氨酸等，难以满足人和动物的生长发育需要。因此，发展高赖氨酸玉米品种不仅可以解决我国粮食短缺和营养不良问题，而且对促进我国畜牧业和饲料加工业的快速发展也具有十分重要的意义。然而，相对于传统玉米品种，高赖氨酸转基玉米的核酸组成发生了一定的变化，其外源基因不仅可以直接通过基因转移、扩散，对其周围环境生物产生影响，其基因的表达产物可以通过根系分泌物、脱落物及根和枝叶残体等进入土壤环境，进而对土壤环境生物产生一定影响。因此，高赖氨酸转基因玉米对土壤环境影响的评价是其大面积应用和推广的前提，其中对土壤环境微生物的影响是环境评价的重要内容，意义重大。
　　本研究通过传统土壤酶活测定、微生物平板计数，QPCR技术和DGGE-cloning技术，以非转基因受体玉米为对照，评估高赖氨酸转基因玉米在苗期、吐丝期、成熟期和成熟后对根际土壤酶活、土壤细菌群落结构及固氮微生物群落结构的影响:
　　1）.以传统的土壤酶活测定方法对玉米四个生长时期（苗期、吐丝期、成熟期和成熟后）中根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活进行测定。
　　2）.通过传统微生物平板计数方法完成了对玉米各生长时期根际土壤中真菌、细菌和放线菌的计数;并以直接法从根际土壤中提取总DNA，利用细菌通用引物扩增16S rRNA的V3区，以DGGE-cloning技术分析玉米各生长时期根际土壤样品中的细菌群落结构。
　　3）.以特异性引物扩增玉米苗期、吐丝期、成熟期和成熟后根际土壤中固氮微生物功能基因(nifH基因)，并通过QPCR技术和DGGE-cloning技术分析高赖氨酸转基因玉米各生长时期中对根际土壤样品中的固氮微生物生物量和群落结构的影响。
　　研究结果显示：
　　1）.通过传统方法对玉米根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活进行了测定，以非转基因玉米为对照，评估高赖氨酸转基因玉米对其根际土壤酶活的影响。结果表明，在玉米整个生长时期（苗期、吐丝期、成熟期和成熟后）中，转化酶酶活有先升高后降低的趋势，而脲酶和过氧化氢酶酶活则不受生长时期的影响;在同一生长时期内与对照相比，高赖氨酸转基因玉米对其根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活均无显著影响。
　　2）.以传统微生物平板计数和DGGE-cloning技术研究高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构的影响，结果显示:
　　(1).与对照相比，转基因玉米根际土壤微生物生物量有一定的差异，在玉米不同生长时期不同的微生物群体的差异也各不相同，玉米根际土壤细菌生物量没有显著差异（显著水平为5％）;放线菌生物量在苗期结果显示，高赖氨酸转基因玉米根际放线菌生物量显著高于非转基因玉米（显著水平为5％）;而真菌计数结果显示，在玉米的吐丝期和成熟后，非转基因玉米根际土壤真菌生物量显著高于高赖氨酸转基因玉米（显著水平为5％）。
　　(2).DGGE-cloning分析结果显示，在玉米四个生长时期内，高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落的影响各不相同，其主要优势条带发生变化也不相同:
　　a）.在玉米生长的苗期，高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构未产生明显影响，其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、TM7、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Firmicutes门;部分细菌类群受到一定程度的抑制，分别属于TM7、Proteobacteria和Bacteroidetes门。
　　b）.在玉米生长的吐丝期，高赖氨酸转基因玉米根际土壤细菌群落结构整体相对稳定，其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、TM7和Nitrospirae门;部分细菌类群受到一定程度的促进作用，分别属于Acidobacteria、Bacteroidetes和Nitrospirae门。
　　c）.在玉米生长的成熟期，高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构整体无明显影响，其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、Acidobacteria、 Bacteroidetes、 Chloroflexi、 Actinobacteria、 TM7、 Firmicutes和Verrucomicrobia门。
　　d）.在玉米生长的成熟后，高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构整体相对稳定，其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、TM7和Firmicutes门。
　　3）.以玉米根际土壤总DNA模板，对固氮功能基因nifH做QPCR和DGGE-cloning电泳分析，结果表明:
　　(1).在玉米四个生长时期中，苗期、吐丝期和成熟期，高赖氨酸转基因玉米均未对根际土壤固氮微生物生物量产生显著影响（显著水平为5％）;在成熟后检测到高赖氨酸转基因玉米根际土壤固氮微生物生物量显著高于非转基因玉米（显著水平为5％）。
　　(2).nifH基因DGGE电泳分析显示，在玉米四个生长时期中，转基因玉米的种植对其根际土壤固氮微生物群落结构产生了一定程度的影响;但对根际土壤固氮微生物群落多样性影响并不显著（显著水平为5％）。将特异性条带经切胶、克隆、测序建树得知，玉米根际土壤主要固氮物类群为Bradyrhizobium，Burkholderia，Azoarcus，Pelomonas，Desulfovibrio和未知菌属(Unknown)。与非转基因玉米相比，在玉米生长的苗期，减弱条带有O(Unknown)和P(Unknown)，消失的条带为H(Azoarcus)和I(Burkholderia);增强的条带有C(Bradyrhizobium)和F(Unknown)，增加条带为K(Pelomonas)。在玉米生长吐丝期，减弱条带有C(Bradyrhizobium)，E(Bradyrhizobium)，L(Burkholderia)，M(Burkholderia)和U(Unknown)，消失的条带为F(Unkown);增强的条带为K(Pelomonas)，O(Unknown)和P(Unknown)，增加的条带为I(Burkholderia)和J(Unknown)。在玉米生长成熟期，增强的条带为B(Azoarcus)，C(Bradyrhizobium)和R(Unknown)，增加的条带为E(Bradyrhizobium)，其他条带无明显变化。在玉米成熟后，减弱的条带为G(Unknown)，H(Azoarcus)，和I(Burkholderia)，增强的条带为E(Bradyrhizobium)和V(Desulfovibrio)，增加的条带为A(Bradyrhizobium)。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 转基因玉米的发展概况

1．1 转基因作物的发展

1．2 高赖氨酸转基因玉米的简介

2 转基因作物对土壤生态系统的影响

2．1 转基因作物对土壤酶活性的影响

2．2 转基因作物对土壤微生物多样性的影响

2．3 转基因作物对土壤固氮微生物群落的影响

3 土壤微生物多样性的研究方法进展

3．1 基于生物或化学的传统研究方法

3．2 基于现代分子生物学的研究方法

第二章 转基因玉米对根际土壤酶活性的影响

1 材料与方法

1．1 试验区概况及试样栽培方法

1．2 试验材料处理及土样采集

1．3 脲酶活性测定方法(urease，水解酶)

1．4 蔗糖酶活性测定(invertase，水解酶)

1．5 过氧化氢酶活测定(catalase，氧化酶)

2 结果与分析

2．1 土壤脲酶酶活性

2．2 土壤蔗糖酶酶活

2．3 土壤过氧化氢酶酶活

3 讨论

4 本章小结

第三章 转基因玉米对根际土壤细菌多样性的影响

1 材料与方法

1．1 土壤微生物平板计数

1．2 菌株、试剂与仪器

1．3 土壤总DNA提取

1．4 玉米根际土壤细菌多样性的PCR-DGGE分析

2 结果与分析

2．1 玉米根际土壤微生物计数

2．2 玉米根际土壤总DNA的提取

2．3 基于DGGE-cloning技术分析高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构的影响

3 讨论

4 本章小结

第四章 转基因玉米对根际土壤固氮微生物功能基因nifH多样性的影响

1 材料与方法

1．1 固氮基因nifH定量PCR

1．2 固氮基因nifH的DGGE电泳分析

2．结果与分析

2．1 固氮基因nifH定量PCR

2．2 玉米根际土壤固氮微生物多样性的DGGE-cloning分析

3．讨论

4．本章小结

全文总结

参考文献

创新点

附录 文中所用的培养基和试剂配方

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢