结球苷蓝的离体再生以及体细胞无性系变异的RAPD分析

摘要

结球甘蓝(Brasssica oleracea L.Var.capitata L.)是我国最主要的蔬菜作物之一，现如今随着分子生物技术的快速发展，基因工程技术近年来已在植物育种中得到广泛应用，植物基因工程技术在农业上的应用为有效改良结球甘蓝的性状提供了新途径。建立高频率的植株再生体系，对于利用外源基因进行遗传转化及育种亲本的无性快繁是十分必要的。
　　 本研究首先利用结球甘蓝下胚轴原生质体和无菌苗下胚轴为材料建立了高效的植株再生体系，获得了最大的再生系数，为遗传转化技术及品种改良与创新等研究奠定了基础;其次利用RAPD分子标记技术分析了两种方式再生的植株之间的体细胞无性系变异。其研究结果如下:
　　 1.以两个早熟结球甘蓝品种‘新夏50’(XX50)、‘强力50’(QL50)的无菌苗下胚轴为材料，对影响原生质体分离、纯化与培养的主要因素进行了研究，实验结果表明:‘QL50’原生质体的分裂频率和植板率都比‘XX50’高，更适合做遗传转化与非对称细胞融合的研究材料;‘XX50’以2.5％纤维素酶R-10+0.05％果胶酶Y-23+9CPW+5mmol·L-1 MES的混合酶液，从4d苗龄的下胚轴上分离出高产率的原生质体，40d后的植板率达到0.43％;‘QL50’以2％纤维素酶R-10+0.05％果胶酶Y-23+9CPW+5 mmol·L-1 MES的混合酶液，从3d苗龄的下胚轴上分离出高产率的原生质体，40d后的植板率达到0.57％。两种材料的原生质体培养在改良B5附加2，4-D0.5mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1、NAA0.2 mg·L-1的液体培养基上，分裂旺盛。形成愈伤组织后经芽诱导和生根培养，获得了再生植株。
　　 2.以结球甘蓝‘强力50’(QL50)和“甘19 cms”下胚轴为外植体，研究了不同激素配比、苗龄和AgNO3浓度等对其不定芽再生的影响，实验结果表明:在不含任何激素以及单独附加不同浓度的6-BA和NAA的MS培养基上，均不能诱导外植体不定芽的分化。‘QL50’下胚轴在MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+AgNO36mg·L-1分化培养基上再生频率最高，为93.00％，最适宜的苗龄为9d，再生系数为9.17。‘甘19 cms’在MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1+AgNO36mg·L-1分化培养基上再生频率最高，为73.80％，最适宜的苗龄为6d，平均再生系数为4.27。外植体在1/2MS生根培养基中添加0.5 mg·L-1 NAA时，不定芽的生根效果较好，生根率达100％，且根系生长健壮。
　　 3.以结球甘蓝‘强力50’(QL50)原生质体再生植株和无菌苗下胚轴再生植株为材料，利用RAPD分子标记技术对其再生过程中产生的体细胞无性系变异进行分析检测。结果表明:从50条随机引物中筛选出条带清晰、多态性丰富、表现稳定的引物14条，在此基础上共扩增出DNA片段253条，其中具多态性的片段73条，表现为新增加带和缺失带，多态率为28.85％，每引物平均扩增的多态位点为5.21个。各植株间遗传相似系数的计算使用聚类分析软件NTsys2.10e完成，采用非加权类平均法(UPMGA)对统计数据进行聚类分析，结果表明:材料间的遗传相似系数介于0.8340-0.9842之间，各再生植株与母本间平均遗传相似系数为0.9304，植株之间存在遗传变异，RAPD分子标记适于结球甘蓝体细胞无性系变异的初步筛选。

目录

声明

摘要

缩略词表

文献综述

1 植物组织培养的研究进展

1．1 植物组织培养技术的应用

2 甘蓝原生质体培养的研究进展

2．1 游离原生质体实验材料的选择

2．2 原生质体的游离纯化

2．3 原生质体培养

2．4 原生质体培养的研究意义

3 甘蓝再生体系的建立

3．1 影晌甘蓝再生的因素

4 转基因技术的研究

4．1 常用的基因转化方法

4．2 转基因技术的优点

4．3 基因遗传转化存在的问题与展望

5 本课题的研究目的与意义

第一章 结球甘蓝下胚轴原生质体培养再生植株

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 原生质体游离

2．2 原生质体培养

2．3 植株再生

2．4 再生植株倍性检测

3 讨论

第二章 结球甘蓝下胚轴高效离体不定芽再生

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 不同激素浓度对不定芽再生的影响

2．2 AgNO3浓度对不定芽再生的影响

2．3 苗龄对不定芽再生的影响

2．4 不定芽的生根

3 讨论

第三章 结球甘蓝体细胞无性系变异的RAPD分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 提取基因组DNA质量检测

2．2 引物筛选及扩增结果

2．3 遗传相似系数(GS)的计算

2．4 聚类分析

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

图版

硕士期间发表的学术论文

致谢