耐盐基因StP5CS转化结球甘蓝的研究

摘要

结球甘蓝是十字花科（Cruciferase）芸薹属（Brassica）植物，是我国重要的叶菜类蔬菜之一。土壤盐渍化严重影响着我国的农业生产和生态环境，我国还有大面积的盐碱地，培育耐盐结球甘蓝品种成为一个日益紧迫而意义重大的研究课题。本研究以几个结球甘蓝高代纯合系为试验材料，建立并优化结球甘蓝再生及遗传转化体系，通过农杆菌介导法和floral-dip转化法两种方法，将耐盐基因StP5CS导入结球甘蓝中，获得转基因植株。采用PCR、Southern blot和RT-PCR等技术对转基因植株进行鉴定，并对其进行了盐胁迫处理。主要研究结果如下:
　　 1.以结球甘蓝G1、G2和G3的具柄子叶和下胚轴为外植体，研究了苗龄、不同激素浓度配比、添加不同浓度AgNO3对外植体不定芽诱导率的影响，建立并优化了结球甘蓝再生体系:5d苗龄的外植体再生频率最高;G1是较好的基因型，其下胚轴接种于MS+1.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA时不定芽的再生频率最高，为76.51％，具柄子叶接种于MS+4.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA时不定芽的再生频率较高，为73.63％;在培养基中添加银离子可以减轻结球甘蓝外植体的褐化，促进不定芽的再生，AgNO3的浓度为7.5 mg/L时再生频率最高，为80.86％。
　　 2.以G1的具柄子叶和下胚轴为受体，采用农杆菌介导法进行耐盐基因StP5CS的遗传转化，对双丙氨膦选择压、侵染时间、预培养时间、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素进行研究，建立并优化了遗传转化体系:4mg/L、8mg/L的双丙氨膦浓度分别可以有效的筛选出下胚轴及具柄子叶的转基因植株;G1下胚轴预培养2d，经OD600≈0.5农杆菌侵染5 min后，接种于添加0.1 mmol/L AS的PM1培养基上共培养2d，转入SM2培养基中筛选，转化率最高达24.47％。
　　 3.采用优化的农杆菌介导转化体系，对G1进行转化，共获得了86株抗性苗。利用PCR扩增、southern blot及RT-PCR检测外源基因StP5CS的整合与表达，结果表明，有23株抗性苗PCR、 southern blot及RT-PCR检测均呈阳性，扩增到639bp的条带，与StP5CS基因完全一致，证实StP5CS基因已经整合进入G1基因组中，并得到了表达。用未转化的结球甘蓝植株及转基因植株进行梯度盐胁迫试验，通过测定SOD、脯氨酸的含量及相对膜透性表明转基因植株耐盐性明显提高。
　　 4.采用floral-dip法转化结球甘蓝G1、G2和G4，通过对影响该转化法的几个关键因素（表面活性剂silwet L-77的浓度、转化液中蔗糖的浓度、植物生长状态）的研究，建立了较优的floral-dip转化法体系，结果表明:silwet L-77的浓度为0.05％、蔗糖的浓度为10％，花序上花蕾的长度＜8 mm的条件下，喷施除草剂Basta后成活率最高，为6.87％。通过对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR检测，确定目的基因已经整合到结球甘蓝的基因组中并得到有效的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 结球甘蓝遗传转化体系研究

1．1．1 结球甘蓝再生体系的建立

1．1．2 导入的目的基因

1．1．3 遗传转化的方法

1．2 转基因植物检测研究进展

1．2．1 核酸层面的检测

1．2．2 蛋白水平的检测

1．3 耐盐研究

1．3．1 盐胁迫对植物的影响

1．3．2 提高植物耐盐性的方式

1．3．3 P5CS基因的研究进展

第二章 结球甘蓝再生体系的建立及优化

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 基因型及外植体对不定芽诱导率的影响

2．2．2 苗龄对不定芽诱导率的影响

2．2．3 不同激素浓度对结球甘蓝不定芽诱导率的影响

2．2．4 银离子对结球甘蓝不定芽诱导率的影响

2．3 讨论

第三章 结球甘蓝遗传转化体系的建立及优化

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料与培养基

3．1．2 质粒和菌株

3．2 试验方法

3．2．1 转化受体准备

3．2．2 菌液准备

3．2．3 遗传转化

3．2．4 双丙氨膦对结球甘蓝外植体选择压的确定

3．2．5 农杆菌侵染时间及预培养时间

3．2．6 农杆菌浓度

3．2．7 共培养时间

3．2．8 添加AS(乙酰丁香酮)

3．3 结果与分析

3．3．1 双丙氨膦对结球甘蓝遗传转化的影响

3．3．2 不同侵染时间及预培养时间对转化率的影响

3．3．3 农杆菌浓度对转化率的影响

3．3．4 共培养时间对转化率的影响

3．3．5 添加AS对结球甘蓝转化率的影响

3．4 讨论

3．4．1 不同外植体类型对双丙氨膦的敏感度不同

3．4．2 不同侵染时间、侵染浓度及预培养时间对转化率影响不同

3．4．3 共培养时间不同转化效率不同

3．4．4 AS对结球甘蓝的转化有促进作用

第四章 农杆菌介导法转StP5CS基因结球甘蓝的获得及检测

4．1 材料

4．1．1 植物材料与培养基

4．1．2 载体及菌株

4．2 方法

4．2．1 外植体及菌液准备

4．2．2 转化

4．2．3 转基因植株的获得

4．2．4 转基因植株的PCR检测

4．2．5 转基因植株的Southern blot检测

4．2．6 转基因植株的RT-PCR检测

4．2．7 转基因结球甘蓝的耐盐性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 转基因植株的获得

4．3．2 转基因植株的PCR检测与分析

4．3．3 转基因植株的Southern blot检测与分析

4．3．4 转基因植株的RT-PCR检测与分析

4．3．5 转基因生理指标的鉴定

4．4 讨论

第五章 floral-dip法转StP5CS基因结球甘蓝的获得及检测

5．1 材料

5．1．1 受体材料

5．1．2 质粒和菌株

5．2 方法

5．2．1 农杆菌培养基

5．2．2 转化液的准备

5．2．3 转化方法

5．2．4 转化条件的优化

5．2．5 种子收获及数据收集

5．2．6 结球甘蓝T1代种子的筛选

5．3 数据处理分析

5．4 转基因植株的鉴定

5．4．1 抗性植株PCR检测

5．4．2 抗性植株southern blot检测

5．4．3 抗性植株RT-PCR检测

5．5 结果与分析

5．5．1 不同浓度的表面活性剂Silwet L-77和基因型对成活率的影响

5．5．2 不同蔗糖浓度对转化率的影响

5．5．3 不同花蕾大小对成活率的影响

5．5．4 T1代种子抗性筛选

5．5．5 分子检测

5．6 讨论

5．6．1 表面活性剂对floral-dip转化的促进

5．6．2 蔗糖浓度对转化效果的影响

5．6．3 适宜处理时期

第六章 全文结论

参考文献

致谢

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