PRRSV抑制猪NK细胞活性作用与CD40L对病毒蛋白GP3/GP5免疫增强作用研究

摘要

猪的繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是目前影响世界养猪业的重要病原之一，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，为单股正链RNA病毒;有严格的宿主细胞趋向性，主要侵害猪体的巨噬细胞系统，特别是猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)。2006年我国大范围暴发高致病性PRRSV，引起了国内外学者高度关注。PRRSV在猪体内可造成持续性感染，但其免疫逃避机制尚不清楚。目前，针对PRRSV的商品化疫苗并不能提供完全有效的免疫保护，人们正致力于开发新的、更有效的疫苗。
　　本研究利用NK细胞毒活性试验方法首次直接分析了NK细胞与PRRSV感染的宿主细胞之间的相互作用，结果表明PRRSV可以抑制NK细胞对其感染的宿主细胞的杀伤作用。同时，采用PCR方法扩增获得猪天然免疫活化因子CD40L基因，设计构建了表达PRRSV GP3、GP5与CD40L的重组腺病毒。经小鼠和猪体免疫试验证明，CD40L对GP3-GP5具有免疫增强作用。上述实验结果为阐明PRRSV免疫逃逸机制和探索PRRSV新型疫苗奠定了基础。具体研究内容和结果分为以下5个部分:
　　1.猪自然杀伤细胞毒活性试验方法建立
　　利用免疫磁珠分选技术从猪外周血淋巴细胞中分离并富集合有NK细胞的CD3-CD172a-CD21-细胞群。分别用终浓度为10U/ml、100U/ml及1000U/ml的rpIL-2或IFN-α在体外刺激NK细胞，分别收集刺激后12h、18h、24h细胞上清，用IFN-γELISA试剂盒检测IFN-γ分泌量。结果表明，终浓度为100U/ml的rpIL-2体外刺激24h后NK细胞IFN-γ分泌水平明显提高。用双染色法进行NK细胞毒活性试验:首先以rpIL-2刺激过的NK细胞为效应细胞，CFSE标记的人红白血病细胞株K562细胞为靶细胞作为阳性对照，按5∶1、15∶1、30∶1的效靶比，在37℃共同培养4h，随后用区分活细胞和死细胞的Live/Dead染料对共培养的细胞进行染色。经过流式分析，结果显示，rpIL-2刺激后的NK细胞对K562的杀伤作用随效靶比的增加而增强，表明rpIL-2可以激活NK细胞细胞毒活性。随后以PRRSV或猪伪狂犬病毒(PrV)感染的肺泡巨噬细胞（PAMs）为靶细胞，再次进行NK细胞毒活性试验。结果表明，rpIL-2激活的NK细胞可以杀伤PRRSV或PrV感染的PAMs细胞。本方法的建立为研究NK细胞与PRRSV感染的肺泡巨噬细胞间的相互作用提供了良好的基础。
　　2.猪自然杀伤细胞与PRRSV感染的肺泡巨噬细胞相互作用研究
　　采用NK细胞毒活性试验方法对猪NK细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的相互作用进行分析。首先利用免疫磁珠筛选出富含NK细胞的细胞群，经rpIL-2刺激后作为效应细胞。分离猪原代肺泡巨噬细胞，体外培养后分别感染感染性PRRSV、UV灭活的PRRSV及伪狂犬病毒(PrV)作为靶细胞。将效应细胞及靶细胞按30∶1的效靶比混合，37℃共培养4h。随后用区分活死细胞的Live/Dead染料染色，用流式细胞仪测定PAMs活性，分析NK细胞对不同处理下PAMs的杀伤作用。结果表明，NK细胞对PRRSV感染的PAMs的杀伤作用在感染后6h开始减弱，直至实验结束(12hpi)。同时，与PrV感染的PAMs相比，NK细胞对PRRSV感染的PAMs的杀伤作用明显低于对PrV感染的PAMs的杀伤作用。UV灭活的PRRSV也可以部分抑制NK的活性，但其抑制效力远小于感染性PRRSV。NK细胞表面CD107a表达量检测结果显示，与未感染PRRSV的PAMs或K562细胞共培养的NK细胞表面CD107a表达量较高;而与PRRSV感染的PAMs共培养的NK细胞及单独培养的rpIL-2活化的NK细胞表面CD107a表达量较低，表明与PRRSV感染的PAMs共培养抑制了NK细胞的脱粒作用。最后，用感染PRRSV后12h的PAMs培养上清液共培养NK细胞和未感染的PAMs及K562细胞，结果显示NK细胞的杀伤作用没有被抑制，表明PRRSV对NK细胞杀毒活性的抑制作用并不是由细胞培养上清液中可溶性分子引起的。综上，PRRSV感染降低了NK细胞对感染细胞的杀伤作用，这可能是PRRSV逃避早期抗病毒免疫应答并造成持续性感染的机制之一。
　　3.表达猪CD40L与PRRSVGP3-GP5的重组腺病毒构建与鉴定
　　天然免疫活化因子CD40L对多种免疫细胞具有特异性免疫调节作用，因而被广泛应用于疫苗开发。本研究首先利用RT-PCR扩增获得猪CD40L基因及高致病性PRRSV SY0608分离株的GP3、GP5基因，再将扩增出的目的基因依次克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，分别构建出穿梭载体pShuttle-CMV-CD40L，pShuttle-CMV-GP35，及pShuttle-CMV-CD40L-GP35。经酶切、测序鉴定正确后将上述三个穿梭载体用PmeI线性化，然后利用电转化使其在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，获得重组腺病毒基因组DNA。将重组腺病毒基因组DNA经PacI酶切线性化，用脂质体法转染HEK-293A细胞，获得重组腺病毒rAd-CD40L、rAd-GP35及rAd-CD40L-GP35（共表达CD40L-2A-GP3-GP5蛋白）。利用RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot方法检测目的蛋白的表达。结果证明，重组腺病毒可以正确表达目的蛋白。
　　4.表达猪CD40L与PRRSV GP3-GP5重组腺病毒小鼠免疫特性研究
　　选择90只BALB/c小鼠，随机分为6组，每组15只。第1、2组分别于背部皮下注射PBS或野生型腺病毒（wtAd）作为对照组;第3-6组分别于背部皮下免疫重组腺病毒rAd-CD40L、rAd-GP35（融合表达GP3-GP5蛋白）、rAd-CD40L-GP35（共表达CD40L-2A-GP3-GP5蛋白）和rAd-CD40L+rAd-GP35（混合免疫），接种剂量为5×1080TCID50/ml，0.2ml/只。隔离饲养3周后用同样方法加强免疫一次。首次免疫后在不同时间点随机抽取5只/组采血和取脾脏，分别检测PRRSV特异性抗体、淋巴细胞增殖指数、IFN-γ和IL-4分泌情况。结果为:第3-6组小鼠在免疫后均可诱导PRRSV特异的体液和细胞免疫应答。与rAd-GP35免疫组相比，单独接种rAd-CD40L-GP35和混合接种rAd-CD40L+rAd-GP35的小鼠产生了更高滴度的中和抗体，并可产生较强的淋巴细胞增殖。同时，rAd-CD40L+rAd-GP35混合免疫组及rAd-CD40L-GP35免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量显著高于rAd-GP35免疫组(P＜0.05)，而IL-4的分泌量则没有显著差异(P＞0.05)。表明猪CD40L可以提高小鼠对GP3-GP5特异性体液免疫水平，并增强Th1型细胞免疫应答。
　　5.表达猪CD40L与PRRSV GP3-GP5重组腺病毒猪体免疫保护作用
　　选择25头PRRSV和PCV2抗体阴性的商品仔猪，随机分组，每组5头。前3组分别颈部接种重组腺病毒rAd-GP35、rAd-CD40L+rAd-GP35和rAd-CD40L-GP35，后两组分别颈部接种腺病毒野毒wtAd和PBS对照，两周后以同样方法加强免疫一次，测定PRRSV特异性ELISA抗体和中和抗体、外周血淋巴细胞(PBMC)增殖反应、IFN-γ和IL-4分泌水平。加强免疫后3周，用同源高致病性PRRSVSY0608分离株攻毒，隔离饲养观察，至第21天剖杀，进行病理变化观察。结果为:rAd-CD40L-GP35免疫组或rAd-CD40L+rAd-GP35混合免疫组诱导的PRRSV特异性ELISA抗体和中和抗体均明显高于rAd-GP35免疫组。用PRRSV体外刺激PBMC，rAd-CD40L-GP35免疫组及rAd-CD40L+rAd-GP35混合免疫组细胞增殖反应显著增强，IFN-γ和IL-4分泌水平明显提高。攻毒后，rAd-CD40L-GP35免疫组及rAd-CD40L+rAd-GP35混合免疫组的仔猪表现出较低的病毒血症及较轻的临床症状与病理变化。上述结果表明，猪CD40L能有效地提高PRRSV GP3和GP5蛋白诱导的体液和细胞免疫反应，并增强GP3-GP5对PRRSV免疫保护作用，猪CD40L具有较好的免疫佐剂作用。
　　综上所述，PRRSV感染的PAMs可以抑制NK细胞对其的杀伤作用，这可能是PRRSV逃避机体抗病毒免疫的策略之一。天然免疫活化因子CD40L可以明显提高PRRSV结构蛋白GP3-GP5在小鼠和猪体内诱导PRRSV特异性体液和细胞免疫反应的能力，提高猪体对GP3-GP5免疫保护作用，具有较好免疫佐剂作用，成功构建重组腺病毒为PRRSV基因工程疫苗研制奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

第一篇 文献综述

第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

1 概况

2 病毒基因组和编码蛋白

3 病毒感染及复制

4 病毒引起的免疫应答

5 疫苗研究

参考文献

第二篇 研究论文

第二章 猪NK细胞毒活性试验方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 PRRSV感染的肺泡巨噬细胞对猪NK细胞活性的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 表达猪CD40L与PRRSV GP3-GP5重组腺病毒的构建与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 表达猪CD40L与PRRSV GP3-GP5重组腺病毒的小鼠免疫特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第六章 表达猪CD40L与PRRSV GP3-GP5重组腺病毒猪体免疫保护效力研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士学位期间发表的论文