不结球白菜雄蕊瓣化系与保持系的差异分析

摘要

不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino），产自中国，是我国人民最喜爱的蔬菜之一。近年来，其需求量不断增长，但主栽品种类型不多，杂种优势品种应用相对受限。这就使得优势品种选育和利用成为当前最紧迫的一项任务。分子标记辅助育种技术能在苗期进行筛选，具有直接、方便、快速、省工等优点。雄蕊瓣化的不结球白菜是一种更彻底的雄性不育类型，可以作为不结球白菜优势品种选育的良好亲本材料，具有一定的研究价值。
　　本文以不结球白菜雄蕊瓣化系W053与保持系W052为试验材料，首先，对两个材料的生理生化指标进行测定，以揭示两个材料间生理水平的差异，进而通过cDNA-AFLP技术从分子水平探寻两个材料间的不同，建立适用于不结球白菜雄蕊瓣化系的cDNA-AFLP反应体系;并通过荧光定量PCR技术验证差异基因的表达，为进一步深入研究不结球白菜雄蕊瓣化特性的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:
　　1.不结球白菜雄蕊瓣化系与保持系的生理生化特性分析
　　分别选取两个材料初花期的不同器官作为样品，测定可溶性糖、可溶性蛋白质、脯氨酸的含量以及SOD、POD、CAT的活性。
　　结果表明，各器官中可溶性蛋白质和可溶性糖含量均表现为花＞大蕾＞小蕾＞叶片，且保持系中含量显著高于突变体。脯氨酸含量表现为大蕾＞花＞小蕾＞叶片，保持系叶片、小蕾和大蕾中脯氨酸高于突变体，而花中低于突变体。超氧化物歧化酶SOD活性在突变体与保持系均表现为花中最高，大蕾中其次，小蕾中较低，而叶片中最低，且突变体中活性均显著高于保持系。过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT的活性在突变体与保持系中均表现为大蕾中高于小蕾，高于花，叶片中活性最低，且突变体中酶活性显著高于保持系。这些结果表明不结球白菜雄蕊瓣化材料中生理代谢类似于氧化胁迫状态下的表现，与保持系差异显著。
　　2.不结球白菜雄蕊瓣化系与保持系基因差异表达的cDNA-AFLP分析
　　于晴天上午9:00剪取0.1g初花期的幼嫩花蕾为样品，采用cDNA-AFLP技术对两个材料的花蕾转录组进行多态性分析。该技术的具体过程如下:
　　1）植物总RNA的提取和双链cDNA的合成;
　　2）双链cDNA片段的酶切和与特定人工接头的连接;
　　3）酶切片段的预扩增和选择性扩增;
　　4）选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
　　结果显示:试验中共选用64对选择性扩增引物，12对引物不能扩增出条带，其余52对引物共获得1346条长度在100bp～1000bp之间的TDFs。平均每对引物扩增出26条清晰的条带，并且出现8个多态性位点。建立了适用于不结球白菜雄蕊瓣化系基因差异显示的cDNA-AFLP反应体系。
　　3.不结球白菜雄蕊瓣化材料中乙烯响应基因表达及乙烯合成分析
　　分别在幼苗期、花芽分化期、现蕾期和花期选取两个材料的根、茎、叶以及初花期的叶片、小蕾、大蕾和花为样品，提取样品总RNA并反转录合成单链cDNA作为模板，采用实时荧光定量PCR技术对从聚丙烯酰胺凝胶上回收得到的差异片段ERFB001进行表达分析，同时采用气相色谱法对两个材料初花期各不同器官中的乙烯释放量及乙烯合成途径中两个关键酶的活性进行测定。
　　生物信息学分析表明，ERFB001与拟南芥中乙烯响应转录因子ERF109相似度很高。荧光定量PCR结果表明，幼苗期、花芽分化期、现蕾期和花期ERFB001在茎和根中表达量差异不大，仅叶片中偏高。初花期，ERFB001在突变体各器官中表达量均显著高于保持系，花中表达量相对于大、小花蕾中呈下降趋势，但表达量仍高于叶片。乙烯释放量表现为突变体中持续升高，保持系中基本不变，且前者各器官中均显著高于后者。ACC合酶与ACC氧化酶活性变化与乙烯释放量的变化基本相同，在花中活性和含量均最高。由此推断，雄蕊瓣化材料中的差异片段ERFB001可能作为乙烯受体，在乙烯的强烈刺激下，进而调控相关下游基因的表达，以调节雄蕊瓣化植株体内保护酶类的活性等，从而使突变体在碳水化合物水平较低，组织内高氧化态的情况下保持良好的适应性。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

第一章 文献综述

1 植物花器官发育的研究进展

1．1 植物花器官发育的分子生物学研究

1．2 植物花器官发育的几种经典模型

1．3 植物花器官发育相关基因的研究

1．4 植物花器官发育相关基因与雄蕊瓣化的关系

2 利用突变体研究基因功能的现状

3 基因差异显示方法及cDNA-AFLP技术的应用

3．1 cDNA-AFLP技术的原理和实验流程

3．2 cDNA-AFLP技术的优点和缺点

3．3 cDNA-AFLP技术在植物表达分析中的应用

4 实时荧光定量PCR技术及其在植物研究中的应用

4．1 实时荧光定量PCR技术概况

4．2 实时荧光定量PCR技术原理及用途

4．3 实时荧光定量PCR解析方法

5 研究的目的、意义及内容

5．1 研究的目的和意义

5．2 实验研究内容

第二章 雄蕊瓣化系与保持系生理特性的差异分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据处理分析

2 结果与分析

2．1 不结球白菜初花期各器官中可溶性糖含量的变化

2．2 不结球白菜初花期各器官中可溶性蛋白质含量的变化

2．3 不结球白菜初花期各器官中脯氨酸含量的变化

2．4 不结球白菜初花期各器官中SOD活性的变化

2．5 不结球白菜初花期各器官中POD活性的变化

2．6 不结球白菜初花期各器官中CAT活性的变化

3 讨论

第三章 雄蕊瓣化系与保持系基因差异表达的cDNA-AFLP分析

1 材料

1．1 试验材料

1．2 主要仪器、设备

1．3 主要试剂

1．4 所用接头和引物

2 方法

2．1 植物总RNA的提取与检测

2．2 双链cDNA的合成与纯化

2．3 双链cDNA片段的酶切和与特定人工接头的连接

2．4 酶切片段的预扩增和选择性扩增

2．5 PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳

3 结果与分析

3．1 总RNA的提取

3．2 双链cDNA的质量

3．3 预扩增

3．4 选择性扩增

3．5 部分选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶图谱

4 讨论

第四章 雄蕊瓣化相关基因的qRT-PCR分析

1 材料

1．1 试验材料

1．2 主要仪器、设备

1．3 主要试剂

2 方法

2．1 差异片段的回收、克隆和测序

2．2 差异片段核酸序列的生物信息学分析

2．3 雄蕊瓣化相关基因片段的qRT-PCR分析

2．4 乙烯释放量及ACC合酶、ACC氧化酶活性的测定

3 结果与分析

3．1 二次PCR扩增产物的回收

3．2 阳性克隆的鉴定

3．3 差异片段核酸序列的生物信息学分析

3．4 目的基因定量表达结果

3．5 初花期各器官中乙烯释放量的变化

3．6 初花期各器官中ACC合酶活性的变化

3．7 初花期各器官中ACC氧化酶活性的变化

4 讨论

全文结论

参考文献

附录

研究成果

致谢