栽培稻及疣粒野生稻中Xa5等位基因的功能研究

摘要

水稻白叶枯病是由黄单胞水稻变种引起的细菌性维管束病害，严重影响着水稻的产量和品质。挖掘新的抗性基因，培育新的抗病品种是目前控制病害发生最经济有效的措施。
　　对植物抗性基因的研究一直以来是植物分子生物学领域的热点，迄今从不同宿主中分离出的多个抗性基因中仅有少部分为隐性抗性基因，这些隐性抗性基因的具体作用机理目前尚不能用广为接受的显性抗性基因的作用机理来进行解释。
　　从水稻中已鉴定出了38个主效抗白叶枯病基因，已被定位的有27个，其中仅有5个为隐性抗性基因。位于第5号染色体短臂的xa5是其中典型的一个隐性抗性基因，编码转录因子ⅡAγ小亚基，和其它显性或者隐性抗白叶枯病基因存在抗性互作，基因结构和其它典型抗性基因的结构都不一样，说明了xa5基因抗病机理的特异性。
　　xa5的序列在水稻抗病品种和感病品种中有两个碱基的差异导致了缬氨酸突变成谷氨酸，而且该突变的氨基酸位点位于蛋白三维结构的表面，可能与蛋白的互作相关。
　　1.OsXa5和OmXa5基因的表达特性
　　分别构建OsXa5和OmXa5基因的亚细胞定位的载体和自身互作载体，通过农杆菌共浸润的方法，在烟草体细胞中观察到OsXa5和OmXa5均为核内定位的基因，未观察到两者存在自身互作的现象。为进一步了解基因在水稻植株中的表达，分别取野生型石狩白毛4个不同生育期的根、茎和叶片，通过半定量PCR检测基因出基因在水稻的全生育期均有表达，且以在最大分蘖期的叶片中表达量最大。水稻野生型石狩白毛2h和24 h后通过半定量PCR检测基因的表达情况。发现两个不同处理时间段基因的表达量差异不显著。但在乙烯、干旱和高温胁迫处理水稻植株24 h后，基因的表达量与2h的处理组相比略有变化，推测OsXa5基因可能参与了植物体应对乙烯和干旱胁迫的应答途径，且基因的表达还受到高温胁迫的影响。
　　2.OsXa5和OmXa5抗病性鉴定及转录组研究
　　超表达目的基因并通过基因工程将其导入水稻等模式作物中已成为研究基因功能的重要方法。将OsXa5和OmXa5基因超表达后，利用农杆菌介导法转入野生型石狩白毛的愈伤组织中，借助PCR检测法和卡方检验筛选获得OsXa5和OmXa5的纯合超表达水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE。
　　对超表达植株种子的萌发状况进行观察发现，与野生型石狩白毛相比，OsXa5-OE的种子萌发率的差异不显著，而OmXa5-OE种子的萌发率较低;对生理表型特征的观察，发现OsXa5-OE平均每株苗的叶片数目较少，OmXa5-OE平均每株苗的叶片数目较多，且OsXa5-OE比OmXa5-OE较早出现衰老的叶片。OsXa5-OE和OmXa5-OE的分蘖数目少于野生型石狩白毛，OsXa5-OE的茎干长度、初生根和次生根的长度均明显小于野生型石狩白毛和OmXa5-OE。通过对水稻植株的结实率和千粒重的测定，对照组野生型石狩白毛的结实率显著高于转基因水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE，且OsXa5-OE的结实率显著高于OmXa5-OE，但三者的千粒重差异不显著。超表达OsXa5基因能够导致水稻植株的矮化，推测可能是由于转基因水稻植株体内的矮杆主效基因作用的结果，也可能是受到赤霉素和油菜素类固醇等植物生长调剂的影响。超表达OmXa5基因使水稻植株种子的结实率显著下降，推测可能是由于OmXa5基因来源于疣粒野生稻，一定程度上保留了疣粒野生稻的性状，具体原因尚未明确。未发现超表达OsXa5和OmXa5基因对水稻植株的正常生长发育有明显的影响。
　　为研究超表达OsXa5和OmXa5基因的植株对病原菌抗性的影响，在植株的最大分蘖期通过剪叶法接种病原菌黄单胞水稻变种菲律宾生理小种PXO99，PXO280和PXO341。对病斑的延伸情况进行观察并在接菌21 d后测量并统计病斑长度。通过对病斑长度的测量发现病原菌黄单胞水稻变种菲律宾菌株PXO99，PXO280和PXO341对OsXa5-OE和OmXa5-OE均存在致病性，且三个小种间的致病性存在差异，以菲律宾菌株PXO99的致病性最强，PXO341的致病性最弱。与对照组野生型石狩白毛相比超表达OsXa5在一定程度上改变了植物体对病原菌黄单胞水稻变种的抗性，而超表达OmXa5能够提升植株对病原菌黄单胞水稻变种的抗性，具有潜在的应用价值。利用基因芯片技术筛选到OsXa5-OE中与野生型石狩白毛相比的有188个差异表达基因并通过定量PCR的验证。在筛选获得的差异表达基因中，有139个基因呈上调表达的趋势，49个基因呈下调表达的趋势，其中包含WRKY家族基因，细胞色素P450家族基因，与泛素相关的基因，与乙烯信号途径相关的基因和过氧化物酶类的基因等。说明OsXa5基因在植物体的防御反应信号途径中是一个重要的效应因子。参与了植物体中的多种信号途径。
　　3.OsXa5和OmXa5互作因子的筛选验证
　　为进一步了解OsXa5和OmXa5的互作因子，构建了水稻酵母双杂交cDNA文库，并对文库质量进行了检测，符合筛库的标准。分别以OsXa5和OmXa5作为酵母双杂交诱饵蛋白，自激活实验表明，OsXa5和OmXa5对酵母菌株MaV203的生长没有毒性，3AT的浓度均为25 mM。通过共转法从水稻cDNA文库中筛选互作的因子，初步筛选获得了73个与OsXa5存在潜在互作的阳性克隆，59个与OmXa5存在潜在互作的阳性克隆。通过序列的比对分析以及双分子荧光互补技术的验证。共筛选获得了4个与OsXa5互作的因子，分别是类似的组蛋白H2A.2.1(Os05g0461400)，类似泛素(Os09g0420800)，类似的光系统Ⅱ放氧复合蛋白1(Os01g0501800)和过氧化氢酶同工酶(Os02g0115700)。3个与OmXa5互作的因子，分别是类似光系统Ⅱ10 kDa多肽(Os07g0147500)、类似捕光复合物Ⅰ(Os06g0320500)和类似谷胱甘肽-S-转移酶Cla47(Os10g0530500)。从体内互作层面上证实OsXa5参与了植物体内的多种抗逆信号途径。OmXa5与光合作用途径中的一个类似效应因子互作，表明OmXa5可能与光合作用介导的信号途径相关，同时参与谷胱甘肽过氧化物酶防御ROS的过程，介导了植物体抗病反应的发生。
　　4.OsXa5和OmXa5的原核表达及GST Pull-Down
　　由于酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术均是在生物体内验证因子间的相互作用关系，而在体外是否互作还尚未知晓，因而通过构建OsXa5和OmXa5带有GST标签的融合蛋白，利用L-Arabinose和IPTG在低温条件下诱导融合蛋白在上清中的表达，并粗提水稻野生型石狩白毛的愈伤总蛋白，进行GST Pull-Down实验，通过SDS-PAGE的检测找出差异条带，割胶回收后进行蛋白序列的测定，试图找出OsXa5和OmXa5的体外互作因子，并通过与体内互作的因子进行比较分析，以期为探索xa5和Xa5在植物体中的作用机制提供基础，且可以为筛选新的抗白叶枯病提供种质资源。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

第一章 文献综述

1．1 水稻白叶枯病(Bacterial blight，BB)简介

1．2 水稻白叶枯病抗性基因的研究

1．3 植物的主要抗病机制

1．3．1 植物过敏反应

1．3．2 系统获得抗性

1．3．3 植物对激素及环境胁迫处理的应答

1．4 互作因子筛选及验证的相关技术

1．4．1 酵母双杂交系统

1．4．2 双分子荧光互补技术

1．4．3 GST Pull-Down技术

1．5 本研究的目的和意义

第二章 OsXa5和OmXa5基因的表达特性

2．1 试剂与仪器

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．2 材料与方法

2．3 结果与分析

2．3．1 OsXa5和OmXa5基因序列的分析比较

2．3．2 OsXa5和OmXa5基因的亚细胞定位

2．3．3 OsXa5和OmXa5基因的自身互作

2．3．4 OsXa5基因在水稻不同生理期组织中的表达

2．3．5 OsXa5对激素处理和环境胁迫处理的响应

2．4 讨论

第三章 OsXa5和OmXa5抗病性鉴定及转录组研究

3．1 试剂与仪器

3．1．1 试剂

3．1．2 仪器

3．2 材料与方法

3．2．1 植物材料

3．2．2 病原菌菌株

3．2．3 超表达植株纯合体鉴定

3．2．4 纯合超表达植株表型测定

3．2．5 OsXa5-OE和OmXa5-OE植株抗病性分析

3．2．6 基因芯片

3．3 结果与分析

3．3．1 OsXa5和OmXa5纯合体植株的获得

3．3．2 OsXa5和OmXa5纯合体檀株超表达量的检测

3．3．3 OsXa5-OE和OmXa5-OE植株表型分析

3．3．4 OsXa5-OE和OmXa5-OE对白叶枯病抗性的影响

3．3．5 基因芯片及定量PCR验证

3．4 讨论

第四章 OsXa5和OmXa5互作因子的筛选及验证

4．1 试剂与仪器

4．1．1 试剂

4．1．2 仪器

4．2 材料与方法

4．2．1 植物材料

4．2．2 菌株与载体

4．2．3 酵母双杂交cDNA文库构建

4．2．4 酵母双杂交筛选与OsXa5和OmXa5的互作因子

4．2．5 BiFC验证互作

4．3 结果与分析

4．3．1 水稻总RNA的提取及mRNA的分离

4．3．2 初级cDNA文库质量的检测

4．3．3 扩增文库质量的检测

4．3．4 酵母双杂交阳性克隆的筛选

4．3．5 BiFC验证互作

4．4 讨论

第五章 OsXa5和OmXa5原核表达及GST Pull-Down

5．1 试剂与仪器

5．1．1 试剂

5．1．2 仪器

5．2 材料与方法

5．2．1 菌株与载体

5．2．2 OsXa5和OmXa5的原核表达

5．2．3 SDS-PAGE检测

5．2．4 Western blot

5．2．5 GST Pull-Down

5．3 结果与分析

5．3．1 OsXa5-pDEST15和OmXa5-pDEST15融合蛋白的诱导表达及检测

5．3．2 OsXa5-pDEST15和OmXa5-pDEST15融合蛋白的GST Pull Down

5．4 讨论

第六章 全文总结

6．1 结论

6．2 下一步工作展望

参考文献

附录

致谢

学术论文发表情况