猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用及Nsp2蛋白单克隆抗体的制备

摘要

猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种猪的急性并高度接触性传染病，PEDV感染后可导致水样腹泻、呕吐、脱水等症状，成年猪很少表现出临床症状。从1976年开始我国就陆续有PED的报道，自2010年下半年以来，该病的流行强度和流行区域在不断的加强和扩大，对哺乳仔猪致死率较高，临床上与猪传染性胃肠炎、轮状病毒和大肠杆菌等疫病较难鉴别诊断，给世界养猪业造成了巨大经济损失。本研究将纯化的猪流行性腹泻病毒和N蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，用于PEDV抗体的检测和血清学调查。此外，利用原核表达系统表达获得重组蛋白Nsp2，将纯化的Nsp2蛋白免疫小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术制备Nsp2蛋白的单克隆抗体，为PEDV诊断和致病机理的研究奠定基础。具体内容如下:
　　1.PEDV全病毒抗原间接ELISA检测方法的建立与初步应用
　　采用差速离心方法获得纯化PEDV，作为包被抗原，建立间接ELISA抗体检测方法，对各项反应条件进行优化，并确定其临界值，同时进行特异性、敏感性、重复性及符合率试验，优化反应条件为:抗原包被浓度为3μg/ml，包被时间为37℃作用2h，1.5％BSA37℃封闭3h，待检血清样品稀释度为1∶100，作用时间为1h，酶标SPA1∶10，000稀释，37℃作用30min，抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性，OD450nm≤0.268判为阴性，介于二者之间为可疑。该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性，批间和批内重复性试验较好，对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测，抗体阳性率达60.31％,与TSZ公司的PEDV抗体检测试剂盒比较，其符合率为91.3％、证明该方法具有较好敏感性、特异性、重复性及符合率，可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。
　　2.PEDVN蛋白间接ELISA检测方法的建立与初步应用
　　将PEDVN蛋白基因克隆至大肠杆菌表达载体，表达获得重组N蛋白，SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果显示，该蛋白分子量大小为55KDa，具有良好的反应原性和特异性。采用亲和层析纯化获得纯化重组N蛋白，作为包被抗原，建立间接ELISA抗体检测方法，优化反应条件为:抗原最佳包被浓度为0.8μg/ml，血清样品最佳稀释度为1∶100，包被时间为37℃作用2h后4℃过夜，1％BSA37℃封闭3h，待检血清作用时间为1h，酶标SPA1∶15，000稀释，37℃作用45min，抗体临界值为OD450nm≥0.312判为阳性，OD450nm≤0.265判为阴性，介于二者之间为可疑。该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性，批间和批内重复试验变异系数为2.6％～9.3％。对江苏、上海、浙江、安徽地区458份猪血清样品进行检测，抗体阳性率达69.21％。与TSZ公司的PEDV抗体检测试剂盒比较，其符合率为89.13％;与建立的猪流行性腹泻全病毒抗原间接ELISA抗体检测方法进行符合率比较，符合率为90％，证明该间接ELISA方法可以为PEDV诊断和流行病学调查提供依据。
　　3.PEDVNsp2基因原核表达与纯化及单克隆抗体的制备
　　为表达PEDV非结构蛋白Nsp2，本研究采用PCR方法从PEDV阳性组织病料中扩增Nsp2基因，，将其克隆至pET-32a载体，将鉴定正确的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导、SDS-PAGE和Westernblot鉴定，获得重组蛋白Nsp2大小约50KD。成功构建了重组表达质粒pET-32a-Nsp2，并应用亲和层析方法纯化了重组Nsp2蛋白;以纯化的PEDVNsp2蛋白免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术进行融合，通过间接ELISA方法进行筛选，获得了1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为6B6。测其细胞上清效价为1∶3，200，腹水效价为1∶2.048×105;Western-blot鉴定表明获得6B6单克隆抗体能够与原核表达的Nsp2蛋白反应.
　　综上所述，本研究利用猪流行性腹泻病毒纯化全病毒抗原和重组蛋白N，成功建立了间接ELISA抗体检测方法，同时制备了PEDVNsp2蛋白的单克隆抗体，为PEDV血清学诊断、免疫抗体检测及流行病学调查提供了简便、快速的检测手段;也为Nsp2蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 猪流行性腹泻病毒的研究进展

1 病毒基本特性

1．1 病毒理化与培养特性

2 流行情况

3 病毒基因组结构与蛋白功能

3．1 病毒基因组结构

3．2 病毒蛋白功能

4 诊断技术

4．1 临床诊断及病理组织变化

4．2 实验室诊断方法

5 免疫与预防

5．1 PEDV灭活疫苗

5．2 PEDV弱毒疫苗

6 控制方法

6．1 加强饲养管理

6．2 返饲治疗

6．3 疫苗注射治疗

参考文献

第二章 猪流行性腹泻病毒全病毒抗原间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 间接ELISA方法的建立及条件优化结果

2．2 间接ELISA阴阳性判定标准的建立

2．3 特异性试验

2．4 敏感性试验

2．5 重复性试验

2．6 符合率分析

2．7 临床血清样品的检测

3 讨论

参考文献

第三章 猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 N基因的扩增

2．2 重组质粒酶切鉴定

2．3 重组N蛋白SDS-PAGE结果

2．4 表达产物Western-blotting鉴定结果

2．5 重组N蛋白可溶性检测

2．6 重组N蛋白表达条件优化

2．7 重组N蛋白的纯化

2．8 间接ELISA方法的建立及条件优化结果

2．9 间接ELISA阴阳性判定标准的建立

2．10 特异性试验

2．11 敏感性试验

2．12 重复性试验

2．13 符合率分析

2．14 临床血清样品的检测

3 讨论

参考文献

第四章 猪流行性腹泻病毒Nsp2基因原核表达与纯化及蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 Nsp2基因的扩增

2．2 重组质粒酶切鉴定

2．3 Nsp2基因序列测定

2．4 重组Nsp2蛋白SDS-PAGE电泳结果

2．5 表达产物Western-blotting鉴定结果

2．6 重组Nsp2蛋白可溶性检测

2．7 重组Nsp2蛋白表达条件优化

2．8 重组Nsp2蛋白的纯化

2．9 杂交瘤细胞株的建立和抗体效价的测定

2．10 单克隆抗体与原核表达蛋白反应的特异性鉴定

2．11 杂交瘤细胞株分泌MAb的稳定性鉴定

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

附录