大豆茎倒伏突变体基因定位、转录组测序及2个木质素合成基因的克隆研究

摘要

大豆(Glycinemax(L.)Merr.）起源于中国，是我国传统农作物，也是当今世界上最重要的植物蛋白和食用植物油的来源。我国大豆单产相对比较低，高产则是育种的首要目标。植株倒伏是作物生产中普遍存在的问题，大豆倒伏后茎秆节间变长，茎柔软匍匐，使光合产物的形成、运输和储藏受阻，已经成为限制高产稳产的重要因素之一。抗倒伏是大豆高产品种必须具备的株型性状，但目前对大豆倒伏性的遗传调控研究相对较少，制约了大豆抗倒伏育种效率。发掘和利用表型明显的茎秆生长异常突变体有助于深入了解大豆茎秆生长发育及倒伏的遗传机制。本研究利用一个EMS诱发的茎倒伏突变体NT82与Williams82、南农1138-2、科丰1号3个野生型材料配制杂交组合，开展茎倒伏特性的遗传与基因定位研究，同时利用茎倒伏突变体亲本进行转录组测序分析，期望综合基因定位争转录组结果获得与茎倒伏相关基因。主要结果如下:
　　遗传试验结果表明各组合F1均不倒伏，对F2及F2∶3群体正常植株与茎倒伏植株分离比例进行卡平方适合性测验，Williams82×NT82和科丰1号×NT82组合F2符合3正常:1茎倒伏的表型分离比例，Williams82×NT82组合F2∶3分离株行合并的正常与突变植株比例也符合3∶1表型分离比例;NG94-156×NT82F2不符合3∶1表型分离比例，但其F2∶3分离株行符合3∶1表型分离比例，推测NT82的茎倒伏特性由一对隐性基因控制。Williams82×NT82和NG94-156×NT82组合F2群体中茎倒伏植株在株高、主茎节数、单株荚数、粒数等性状值均低于正常植株。利用群体NG94-156×NT82将茎倒伏基因初步定位在了I连锁群的Satt614和Satt440之间，两标记间遗传距离为80.8cM;利用群体Williams82×NT82将茎倒伏基因初步定位在了I连锁群的Satt270和Satt292之间，遗传距离为32.67cM。通过结果分析初步推测茎倒伏基因sl位于I连锁群同时这个基因位于标记Satt614和Satt440之间。
　　利用转录组测序技术检测NT82大豆茎倒伏材料野生型和突变型茎组织的转录差异。突变植株茎部出现倒伏时，取突变型植株茎中间部位（第六节间）和弯曲部位（即第九和第十节间），野生型植株茎第九和第十节间。NTM-1和NTM-2分别为实验组茎中间部位、弯曲部位，NTW为对照组。通过分析得到NTM-1和NTW有2177个差异表达基因，NTM-1和NTM-2有1006个差异表达基因，NTM-2和NTW有2812个差异表达基因。利用elimGO算法计算每个GO的显著性水平，筛选差异基因所显著影响的GO功能，共发现茎倒伏突变体NT82不同生长期的差异基因与倒伏相关的功能有:钙离子结合、应激反应、脂氧合酶的活性、氧化还原酶活性、木聚糖转移酶活性、细胞壁。倒伏突变体和野生型差异基因与倒伏相关的功能有:钙离子结合、木聚糖转移酶活性、细胞壁、应激反应、脂氧合酶活性、碳水化合物代谢过程、次生细胞壁生物合成、木质素代谢过程、纤维素合酶活动、苯丙烷代谢过程、纤维素生物合成过程、苯丙氨酸解氨酶活性。筛选出4个可能和茎倒伏相关的基因(GLyma18g02690、Glyma06g14200、Glyma20g16100、Glyma05g03780)。使用软件MATS鉴定转录本的剪接位点，发现大豆NT82含有7种可变剪接类型，其中内含子事件是最普遍的。
　　用同源克隆的方法从NT82、南农1138-2、南农94-156中克隆获得cDNA全长序列GmCAD4和GmCOMT。通过BioXM2.6生物信息学分析表明GmCAD4长度为1077bp，编码358个氨基酸，蛋白质分子量为39.15KDa，等电点为5.81，有5个外显子，4个内含子;GmCOMT长度为1098bp，编码365个氨基酸，蛋白质分子量为39.90KDa，等电点为5.77，有4个外显子，3个内含子。根据亚细胞定位分析可知，GmCAD4基因主要定位于细胞质中，GmCOMT基因主要定位于内质网中。多重比对结果显示大豆GmCAD和GmCOMT基因与其双子叶植物菜豆的同源性最高。利用Gateway方法，设计了含有attB位点的两对特异性引物，进行GmCAD4和GmCOMT基因的BP反应，其阳性克隆检测图表明GmCAD4和GmCOMT基因已插入载体，测序结果与原序列相符，证明片段正确，得到入门载体pDONR/Zeo-GmCAD4和pDONR/Zeo-GmCOMT。进行GmCAD4和GmCOMT基因LR反应，经阳性克隆检测以及测序比对，证明获得植物过表达载体pMDC83-GmCAD4和pMDC83-GmCOMT。

目录

声明

摘要

缩略词表及英汉对照

第一章 文献综述

1．1 作物倒伏性研究概况

1．1．1 作物倒伏的概念

1．1．2 作物倒伏的类型

1．1．3 作物倒伏现象的原因

1．1．4 倒伏对作物生产的影响

1．1．5 作物茎秆形态结构特征和化学成分与抗倒伏关系

1．1．6 茎秆木质素含量与作物抗倒伏性的关系

1．2 主要农作物抗倒伏遗传育种研究概况

1．2．1 小麦

1．2．2 水稻

1．2．3 玉米

1．3 大豆抗倒伏研究概况

1．4 木质素生物合成及其调控研究进展

1．4．1 木质素组成及其合成途径

1．4．2 木质素调控研究进展

1．5 咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)

1．5．1 COMT基因特征

1．5．2 COMT基因对植物木质素合成调控的研究

1．6 肉桂醇脱氢酶(CAD)

1．6．1 CAD基因的特征

1．6．2 CAD基因对植物木质素合成调控的研究

1．7 转录组测序技术

1．7．1 转录组测序技术的涵义

1．7．2 转录组测序技术流程

1．7．3 转录组测序技术优势

1．7．4 转录组测序技术的应用

1．8 本研究的目的和意义

第二章 大豆茎倒伏突变体发掘、性状遗传与基因初定位

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 田间试验及性状调查

2．2．2 大豆叶片DNA提取

2．2．3 分子标记SSR检测

2．2．4 突变体基因定位的方法

2．3 结果与分析

2．3．1 大豆茎倒伏突变体的遗传分析

2．3．2 大豆茎倒伏突变体基因的初定位

2．4 讨论

第三章 大豆茎倒伏突变体的转录组测序与功能分析

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 大豆茎倒伏材料种植和处理

3．2．2 总RNA的提取

3．2．3 RNA质检

3．2．4 测序文库构建

3．2．5 上机测序

3．2．6 测序数据处理及分析

3．3 结果

3．3．1 总RNA、测序文库质检结果及数据预处理

3．3．2 样品与参考基因组的对比分析

3．3．3 差异基因分析

3．3．4 差异表达基因GO功能注释分析

3．3．5 差异基因通路分析

3．3．6 可变剪接的类型

3．4 讨论

3．4．1 与大豆倒伏性相关的重要候选基因

3．4．2 基因可变剪接分析

第四章 木质素生物合成相关基因GmCAD4、GmCOMT的克隆

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 供试菌株和载体

4．1．3 试剂

4．1．4 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 RNA提取

4．2．2 cDNA第一链的合成

4．2．3 基因扩增的PCR反应

4．2．4 琼脂糖凝胶的制备

4．2．5 PCR产物回收

4．2．6 目的片段与载体连接

4．2．7 连接产物的转化

4．2．8 质粒的提取

4．2．9 植物过表达载体pDONR／Zeo-GmCAD4、pDONR／Zeo-GmCOMT的获得

4．2．10 BP反应

4．2．11 LR反应

4．2．12 基因的生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 GmCAD4和GmCOMT的克隆

4．3．2 大豆GmCAD4、GmCOMT过表达载体的构建

4．3．3 GmCAD4和GmCOMT序列生物信息学分析

4．4 讨论

全文结论与创新之处

参考文献

附录

致谢