猪转基因克隆胚胎体外生产的研究

摘要

动物转基因技术就是指利用分子生物学技术，在遗传学的和DNA重组技术基础上将分离得到的外源目的基因（重组）导入动物受精卵或早期胚胎细胞中，使之整合到宿主细胞的基因组内，稳定地遗传给下一代的一种生物技术手段。其目的是改造生物的遗传物质，获得一些在性状、营养和消费品质等方面具有优良特性的转基因动物。生产转基因动物已成为当今生命科学一个发展最快、最热门的领域。转基因动物技术在建立动物模型，研究基因功能，治疗人类疾病，动物抗病育种，异种器官移植和生物制药等许多方面都具有广泛的应用价值。其中在畜牧业中，转基因技术为改造动物品种开辟了新途径，通过转基因技术将某些促进生长、抗病性强的基因导入原来不具备这些性能的细胞中，经过转基因克隆有助于培育动物新品种。尽管转基因动物技术在以上所述的广泛领域都具有重要的应用潜力，但是转基因动物的成功率和成活率依然偏低，转入的外源基因整合率低、效果不稳定，转基因动物的安全性问题等等，严重制约了该技术的进一步发展与应用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种可引起成年母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病的严重传染病，给我国猪业生产带来巨大的经济损失。本研究拟将RNA干扰(RNAi)基因沉默技术与体细胞核移植技术相结合，体外生产抗猪蓝耳病shRNA转基因克隆胚胎，侧重优化和完善猪体细胞转基因克隆技术程序，分析采用该技术方法可能存在的一些问题;以期提高猪转基因克隆胚胎的体外生产效率。试验主要以猪体外成熟卵母细胞为材料，研究猪体细胞克隆胚胎体外生产的关键技术，建立较为完善的技术体系，并在此基础上稳定生产猪抗PRRSV转基因克隆胚胎。试验结果如下:
　　1.激素处理对猪卵母细胞成熟的影响取屠宰场采集的猪卵巢，用抽吸法采集直径2～5mm卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，所用基础培养液为TCM-199并添加10％猪卵泡液(PFF)、5％胎牛血清(FBS)、10ng/mL表皮生长因子(EGF)和0.1mg/mLL-半胱氨酸。对照组COCs培养液中额外添加10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)培养42h。试验组COCs头20h的培养液同对照组，后移入无激素的TCM-199基础液中培养22h。统计卵母细胞成熟率，对照组卵母细胞成熟培养后的第一极体(pbI)排出率为73.23％，而试验组pbI排出率为86.48％，两组差异显著(P＜0.05)。试验表明，采用先在添加10IU/mL PMSG和10IU/mL hCG激素的TCM-199基础培养液中培养20h，再转入无激素TCM-199基础培养液中培养22h的成熟培养方案，可获得较好的卵母细胞成熟率和胞质质量。
　　2.细胞周期同期化处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响以猪转基因胎儿成纤维细胞作为供核细胞，试验组分别用血清饥饿法和接触抑制法诱导转基因供核细胞进入G0/G1期，猪体外成熟卵母细胞为受体，进行体细胞核移植试验。结果显示细胞周期同期化处理对转基因克隆胚胎的发育具有一定的影响，试验组囊胚发育率分别为26.79％和21.78％，均高于对照组囊胚发育率(16.67％)，但三组间差异不显著(P＞0.05)。
　　3.供核细胞保存方式对猪转基因克隆胚胎发育的影响试验分3组（新鲜消化组、4℃冷藏组和-70℃冷冻组），比较不同保存方式对猪转基因克隆胚胎发育的影响。结果表明，4℃冷藏组和新鲜消化组供核细胞所获囊胚发育率均显著高于-70℃冷冻组（分别为20.17％和20.56％对7.79％，P＜0.05），而4℃冷藏组和新鲜消化组间的囊胚发育率无显著差异(P＞0.05)。
　　4.激活方法对克隆胚胎发育的影响以猪胎儿成纤维细胞为核供体构建克隆重构胚，在理想参数1.5kV/cm、40μs和1DC下，分别研究了电激活以及电激活后6-DMAP化学激活处理重构胚后对猪克隆胚发育的影响，结果显示无论是单纯使用电激活还是电激活加6-DMAP处理，两组间卵裂率和囊胚发育率均无显著差异(69.39％对70.53％,25.51％对22.11％,P＞0.05)。
　　5.不同转基因供核细胞对猪转基因克隆胚胎早期发育的影响分别以猪胎儿成纤维细胞(pFF)和耳成纤维细胞(pEF)为核供体，分别进行体细胞核移植，比较它们对克隆胚发育的影响，结果显示虽然两组的卵裂率无显著差异(77.31％对80.00％，P＞0.05)，但pFF组的囊胚发育率(23.71％)要显著高于pEF组(15.88％)。
　　6.TSA处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响0nM和50nM TSA处理核供体细胞，获得囊胚发育率（20.47％和17.67％）显著高于100nM TSA组(10.38％)，而0nM TSA组与50nM TSA组之间囊胚发育率无显著差异(P＞0.05)。用50nM TSA处理转基因克隆胚胎24h，可获得24.82％的囊胚发育率;若既用TSA处理供核细胞又处理胚胎，所获囊胚发育率(28.09％)显著高于不用TSA处理对照组(P＜0.05)。

目录

声明

论文说明

摘要

符号及缩略语

第一章 哺乳动物体细胞核移植的研究与应用

1 哺乳动物体细胞核移植研究概况

2 体细胞核移植的技术程序

2．1 受体细胞的选择和去核

2．2 供核细胞准备

2．3 克隆重构胚构建

2．4 重构胚激活

2．5 重构胚体外培养

2．6 影响体细胞核移植的因素

3 体细胞核移植与转基因动物生产

3．1 转基因动物研究现状

3．2 转基因动物制作方法

3．3 转基因技术应用

4 动物转基因克隆的前景

第二章 猪转基因克隆技术程序的优化

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂及药品

1．3 试剂配置

1．4 工具的制备

2 试验方法

2．1 卵母细胞采集

2．2 猪卵母细胞的体外成熟培养

2．3 猪耳成纤维细胞和胎儿成纤维细胞的建系和培养

2．4 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒转基因细胞系的建立

2．5 转基因供体细胞细胞周期同期化

2．6 体细胞核移植

2．7 试验设计

2．8 统计分析

3 结果

3．1 激素处理对猪卵母细胞成熟的影响

3．2 细胞周期同期化处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响

3．3 供核细胞保存方式对猪转基因克隆胚胎发育的影响

3．4 激活方法对猪转基因克隆胚胎发育的影响

4 讨论

4．1 激素处理对猪卵母细胞成熟的影响

4．2 细胞周期同期化处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响

4．3 供核细胞保存方式对猪转基因克隆胚胎发育的影响

4．4 激活方法对猪转基因克隆胚胎发育的影响

第三章 抗猪蓝耳病shRNA转基因克隆胚胎体外生产

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂及药品

1．3 试剂配置

1．4 工具的制备

2 试验方法

2．1 猪卵母细胞采集和体外成熟培养

2．2 供核细胞准备

2．3 受体细胞准备

2．4 核移植操作

2．5 重构胚激活

2．6 重构胚体外培养

2．7 试验设计

2．8 统计分析

3 结果

3．1 转基因核供核细胞对猪转基因胚胎早期发育的影响

3．2 TSA处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响

4 讨论

4．1 不同转基因核供核细胞对猪转基因克隆胚胎发育的影响

4．2 TSA处理对猪转基因克隆胚胎发育的影响

参考文献

全文结论

图版及说明

致谢