大豆热激蛋白90(Hsp90)家族基因的克隆及功能初步研究

摘要

大豆[Glycine max(L.) Merr.]是一种重要的农作物和经济作物，它对于改善人类食物结构，满足人类对植物蛋白和油脂的需求都具有重要的作用。然而在大豆生长和发育过程中经常会遭受高温、高盐、干旱等非生物胁迫的影响，造成产量的损失和品质变化，从而导致严重的经济损失，因此对大豆应答非生物胁迫的不同机制以及他们后天获得的胁迫抗性进行研究具有重要的意义。逆境胁迫会导致生物体蛋白不正常的折叠，从而引起细胞产生多种问题，因此所有物种都具有专一的蛋白组装系统用以维持蛋白的平衡以及减轻胁迫造成的伤害。这个系统的指令中心就是分子伴侣和蛋白重塑因子。这类蛋白中很多都会受到热激的上调表达，因此这些能够受到热激上调表达的蛋白被称为热激蛋白(Heat shock protein，Hsp)，而Hsp90被认为是这个蛋白系统平衡的中心。近年来很多植物的Hsp90都已被发现会受到逆境胁迫的的诱导表达，但是深入的研究并不多见。本论文主要针对大豆GmHsp90在非生物胁迫下的相关功能进行了研究，主要结果如下:
　　1.通过同源比对，发现大豆基因组中含有12个完整的Hsp90同源序列，并将其从大豆耐旱品种Y7F9002中全部分离。初步的生物信息分析结果表明，这12个基因分布于不同的大豆染色体上，开放阅读框(ORF)大小为2097-2447bp，蛋白分子量为80.13-93.56kDa。多重序列比对结果显示12个GmHsp90蛋白具有高度的保守性，与其他物种的Hsp90相同，近N端区域都含有Hsp90家族的特征元件‘Y-x-[NQHD]-[KHR]-[DE]-[IVA]F-[LM]R-[ED]'和ATP结合域。基于大豆GmHsp90序列的高度保守性以及目前对Hsp90系统命名的原则将这12个GmHsp90分为4个亚家族，分别命名为GmHsp90A1-A6，GmHsp90B1-B2，GmHsp90C1.1，C1.2，GmHsp90C2.1，2.2，以便于下一步的研究。
　　2.利用实时荧光定量PCR对这12个GmHsp90基因在大豆不同组织中的表达特性进行检测。结果表明，GmHsp90在大豆的根，茎，叶，花和荚中都有表达，但表达丰度各异，其中系统发育分析结果中来源于同一分支的GmHsp90具有类似的表达模式。利用实时荧光定量PCR对大豆GmHsp90基因在不同的逆境胁迫下的表达模式进行研究，结果表明GmHsp90能够迅速和剧烈的响应热激胁迫，特别是GmHsp90A1和GmHsp90A2。这些基因对渗透胁迫和盐胁迫也都具有应答，但是响应速度和剧烈程度要远低于对热激胁迫。而对这12个基因进行低温胁迫处理后发现他们对短期的低温胁迫并没有强烈的应答。从逆境胁迫表达模式研究结果中发现虽然GmHsp90As、GmHsp90Bs、GmHsp90C1s和GmHsp90C2s对热、盐和渗透胁迫都有应答，但是它们的表达模式具有明显的差异。此外，虽然归类于GmHsp90As但是GmHsp90A1和GmHsp90A2的表达模式也明显与其余GmHsp90A基因有差异，因此本研究进一步将12个GmHsp90分成5种不同的类型。
　　3.通过对大豆12个GmHsp90基因进行初步研究后，从中选择了5个具有代表性的大豆GmHsp90（GmHsp90A2，GmHsp90A4，GmHsp90B1，GmHsp90C1.1和GmHsp90C21.1）进行模式植物拟南芥的转化，通过研究转基因拟南芥在非生物胁迫下的表现对GmHsp90基因功能进行进一步的研究。对转基因拟南芥种子进行高温，盐和渗透胁迫处理后发现除了GmHsp90B1转基因株系，过表达GmHsp90的拟南芥种子的萌发率显著高于对照植株。对生长3周的转基因拟南芥植株进行了高温，盐和渗透胁迫处理后发现转GmHsp90拟南芥的在胁迫下鲜重的下降程度显著低于对照植株。在持续高温胁迫后对转基因拟南芥植株的败育程度进行统计，结果表明转基因植株的败育率显著低于对照植株。这些结果说明过表达GmHsp90基因可以降低非生物胁迫对拟南芥的伤害并且在一定程度上维持拟南芥的生长和发育。进一步测定转基因拟南芥的叶绿素和MDA含量等生理指标，结果表明过表达GmHsp90基因可以防止植物体内叶绿素的损失和降低MDA的含量，由于这两个生理指标与非生物胁迫过程中产生氧化胁迫密切相关，我们认为GmHsp90基因，特别是GmHsp90A基因，在非生物胁迫下参与了降低氧化胁迫伤害的过程，以维持转基因拟南芥的生长和发育。对转基因拟南芥体内脯氨酸含量检测的过程中发现在正常条件下GmHsp90A和GmHsp90C1的转基因植株中脯氨酸的积累发生了异常，而这种脯氨酸的异常积累可能是由于过表达GmHsp90基因扰乱了脯氨酸和P5CS之间的反馈抑制平衡系统所导致的。同样，对转基因拟南芥进行钙离子胁迫处理后发现，转基因拟南芥对钙离子的胁迫也具有一定的抗性。而这种抗性产生的原因，可能是过表达GmHsp90基因降低了转基因拟南芥体内O2-等氧化胁迫相关物质，从而一定程度上阻止钙离子和ROS之间互作而产生的严重的氧化胁迫。
　　4.选择转基因拟南芥研究结果中抗性较好的GmHsp90A2进行大豆的遗传转化研究。经过农杆菌介导的大豆整体转化法使得GmHsp90A2在大豆品种Y7F9001过表达，最终得到多个阳性植株。利用实时荧光定量PCR对这些转基因株系中GmHsp90A2的表达进行检测发现，部分株系中GmHsp90A2的表达受到了抑制，对这些株系在逆境胁迫下的叶绿素含量，MDA含量和O2-含量测定发现，这些株系受到更严重的氧化胁迫的伤害，对逆境胁迫的抗性也随之降低。该结果进一步说明GmHsp90A2在降低逆境胁迫下氧化胁迫对植物的伤害中确实起着重要的作用。
　　5.鉴于GmHsp90A2对非生物胁迫强烈的应答效果，对其启动子进行了克隆研究。从GmHsp90A2的5'非翻译区上游分离了一段3，913bp的序列。通过将该启动子区域与GUS基因连接，构建瞬时表达载体并侵染洋葱表皮细胞和拟南芥。GUS组织化学染色结果表明，该序列具有启动子的活性并且能够通过转基因方式在植物体内行使功能，使得GUS基因在植物体内稳定地表达。对侵染后的洋葱表皮细胞进行热激处理并进行GUS染色后发现，GmHsp90A2启动子能够受到热激胁迫的强烈诱导。初步确认分离得到的GmHsp90A2启动子序列是一个具有启动子活性并且能够受到热激胁迫强烈诱导的启动子，可以作为候选的诱导型启动子应用于转基因研究和大豆转基因育种。

目录

声明

摘要

缩略语

第1章 文献综述

1 非生物胁迫对植物生理的影响

1．1 非生物胁迫对植物膜系统的影响

1．2 非生物胁迫对植物水分代谢的影响

1．3 非生物胁迫对植物光合作用的影响

1．4 非生物胁迫对植物呼吸作用的影响

1．5 非生物胁迫对植物物质代谢的影响

2 植物逆境相关的下游功能基因及其在逆境胁迫下的作用

2．1 渗透保护物质

2．2 ROS清除物质

2．3 离子转运体

2．4 水通道蛋白

2．5 分子伴侣

2．6 蛋白水解相关蛋白

3 热激蛋白家族的研究进展

3．1 热激蛋白的特点

3．2 热激蛋白家族的分类

3．3 热激蛋白在非生物胁迫中的作用

3．4 Hsps的作用网络

3．5 Hsps与其他胁迫应答机制之间的互作

4 Hsp90家族的研究进展

4．1 Hsp90的结构和功能

4．2 Hsp90的分类

4．3 Hsp90的互作蛋白及互作机制

4．4 植物Hsp90在逆境胁迫下研究进展

4．5 Hsp90在植物生长发育中的作用

5 本研究的目的意义和主要内容

第2章 大豆Hsp90基因的克隆及分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 菌株和载体

1．3 主要试剂

1．4 大豆植株的处理和总RNA的提取

1．5 大豆Hsp90同源序列的搜索及引物设计

1．6 大豆Hsp90基因的克隆与测序

1．7 大豆Hsp90基因的序列分析

1．8 实时荧光定量PCR分析

2 结果

2．1 大豆Hsp90基因序列分析

2．2 大豆Hsp90家族蛋白的鉴定及系统发育分析

2．3 大豆Hsp90基因在大豆不同组织中的表达特性分析

2．4 大豆Hsp90基因在非生物胁迫下的表达模式分析

3．讨论

第3章 大豆GmHsp90过表达拟南芥及转基因拟南芥在非生物胁迫下的功能分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 质粒及菌株

1．3 主要试剂

1．4 载体构建及根癌农杆菌的转化

1．5 拟南芥的培养及侵染

1．6 阳性植株的筛选及纯化

1．7 转基因拟南芥的逆境胁迫处理

1．8 逆境胁迫下转基因拟南芥植株生理指标测定

1．9 实时荧光定量PCR分析

2 结果

2．1 GmHsp90植物表达载体构建

2．2 转基因拟南芥阳性植株的检测及纯化

2．3 过表达大豆GmHsp90提高了转基因拟南芥在非生物胁迫下的萌发率

2．4 过表达大豆GmHsp90基因影响转基因拟南芥植株在非生物胁迫下的生长和发育

2．5 过表达大豆GmHsp90基因影响逆境胁迫下拟南芥植株的逆境相关生理指标

2．6 过表达大豆GmHsp90基因导致拟南芥体内脯氨酸含量的异常

2．7 过表达大豆GmHsp90基因可以提高转基因拟南芥对Ca2+胁迫的抗性

2．8 过表达大豆GmHsp90基因影响转基因拟南芥中部分逆境胁迫相关基因表达

3 讨论

第4章 GmHsp90A2转化大豆以及在非生物胁迫下的功能初步分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 质粒和菌株

1．3 主要试剂

1．4 载体构建及农杆菌的转化

1．5 大豆的种植及侵染

1．6 转基因大豆植株的筛选

1．7 转基因大豆的逆境胁迫处理

1．8 逆境胁迫下转基因大豆植株生理指标测定

1．9 实时荧光定量分析

2 结果

2．1 大豆品种Y7F9001除草剂抗性筛选

2．2 转GmHsp90A2大豆阳性植株的筛选及检测

2．3 不同GmHsp90A2转基因大豆株系对非生物胁迫的抗性具有差异

2．4 GmHsp90A2基因表达受抑制的转基因大豆受到较强的氧化胁迫伤害

3 讨论

第5章 大豆GmHsp90A2启动子的克隆

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 质粒和菌株

1．3 主要试剂

1．4 大豆GmHsp90A2启动子克隆及序列分析

1．5 载体构建及农杆菌转化

1．6 农杆菌的侵染

1．7 拟南芥的培养及侵染

1．8 GUS染色

2 结果

2．1 GmHsp90A2启动子序列的克隆

2．2 GmHsp90A2启动子元件的预测分析

2．3 GmHsp90A2启动子载体构建

2．4 GmHsp90A2启动子活性检测

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

在读期间发表的论文

致谢