棉花细胞质雄性不育的转录组学与代谢组学研究

摘要

雄性不育是指植物不能产生正常可育的花药、花粉或者雄配子。细胞质雄性不育（CytoplasmicMaleSterility,CMS）则是由细胞质和细胞核互作而导致的雄性不育。细胞质雄性不育在杂种优势利用中具有重要的应用价值，同时又是研究核—质互作的良好材料。目前，虽然植物细胞质雄性不育形成的分子机制尚未完全被揭示，但是大多数研究结果表明细胞质雄性不育基因位于线粒体基因组上，线粒体基因组重排可能导致线粒体功能紊乱，并对核基因组表达产生强烈的反向调控作用，进而导致细胞质雄性不育的形成。本实验室前期研究指出细胞质反向调控作用可能是棉花细胞质雄性不育形成的主要分子机制。棉花细胞质雄性不育系和保持系是一对同核异质系，研究花粉发育过程中两者花药基因表达谱的差异，可以深入了解细胞质雄性不育基因的反向调控作用，揭示棉花细胞质雄性不育形成的分子机制。代谢组作为基因组表达的最终产物，直接决定细胞或组织的生物化学表型，代谢组学研究可以更好地解析细胞质雄性不育形成的生化机制。将转录组和代谢组数据进行整合分析，描绘基因作用网络和代谢作用网络以及两者之间的相互关系，是揭示细胞质雄性不育形成及其调控机理的有效途径。
　　本研究以棉花细胞质雄性不育系中棉所12A（细胞质来自104-7A）和保持系中棉所12为研究材料，采用Illumina新一代高通量测序技术对花药转录组表达谱进行比较分析:共鉴定3，190个表达差异的基因(P≤0.001，|log2Ratio|≥1)。差异基因的GO功能富集和生物途径富集分析结果表明，这些差异基因主要参与碳水化合物代谢途径、脂肪酸代谢途径以及次级代谢物生物合成与代谢途径，尤其是苯丙素生物合成与代谢途径、黄酮类生物合成途径等。Mapman分析结果表明差异基因也主要定位在这些途径中。其中，有474个差异基因为转录因子，属于bHLH、C3H、MYB-related、PHD、MADS、Ap2-EREBP、FAR1、mTERF、WRKY、Orphans、MYB、C2H2、NAC、TRAF、ABI3VP1和Tify等57个家族，因此反向调控作用主要通过转录水平调控实现。另外，有146个差异表达基因参与包括乙烯、生长素、脱落酸、赤霉素、细胞分裂素、水杨酸、茉莉酸以及油菜素内酯等8大类激素的合成、响应以及信号转导过程。
　　采用代谢物衍生化程序结合气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)两种分析技术对不育系和保持系花药差异积累的代谢物进行分离和鉴定。通过GC-MS分析共获得141个重复性较好的色谱峰。匹配度达70％以上且物质名称已经被准确鉴定的物质有82种，其中43种在不育系和保持系中有显著性差异，主要包括糖类、有机酸和氨基酸等，这些物质主要参与植物激素生物合成途径、苯丙素等次级代谢物合成途径、ABC转运和芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸等）生物合成途径与代谢途径。LC-MS分析分正离子模式和负离子模式分别进行，分别检测到得分在70分以上的色谱峰2，403和2，313个，将其中90分以上、差异倍数大于32的色谱峰进行搜库分析，分别鉴定出255、207种化合物。其中在不育系中相对于保持系中积累上调的组分有31种，下调的组分有431种。主要为苯丙素、黄酮类、萜类等化合物，主要涉及苯丙素生物合成、黄酮类生物合成等次级代谢物生物合成途径。
　　对转录组和代谢组数据进行综合分析，推测苯丙素、黄酮类物质合成受阻、代谢加快导致体内这类物质积累减少，这可能是导致104-7A棉花细胞质雄性不育形成的原因之一。

目录

声明

摘要

本文主要缩略词

第一章 棉花细胞质雄性不育研究进展

1 植物细胞质雄性不育概述

2 棉花细胞质雄性不育研究进展

2．1 棉花细胞质雄性不育的细胞学、生理生化及分子生物学研究

2．2 细胞质雄性不育形成的分子机制

3 反向调控途径

3．1 反向调控的途径

3．2 反向调控途径可能的信号分子

3．3 细胞质雄性不育涉及的线粒体基因

3．4 细胞质雄性不育反向调控的核中目标基因

第二章 转录组学研究进展

1 转录组学技术研究进展

1．1 454测序

1．2 Illumina测序

1．3 SOLiD测序

2 转录组在植物研究中的应用

2．1 新基因发掘

2．2 代谢途径的确定

2．3 植物细胞特性的改造

3 转录组数据分析

3．1 转录组数据分析软件及数据库

3．2 转录组学与其他组学技术的综合运用

第三章 代谢组学研究进展

1 代谢组学概述

2 代谢组学研究方法

3 代谢组学的数据分析方法

3．1 代谢组学数据预处理

3．2 数据降维处理

3．3 数据库及数据网络

4 代谢组学研究的应用

4．1 疾病诊断

4．2 在植物学研究中的应用

5 代谢组学与转录组学、蛋白质组学技术整合分析

本研究的目的和意义

第四章 不育系与保持系花药的转录组比较分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 溶液试剂

1．3 试验方法

1．4 Illumina测序

2 结果与分析

2．1 数据比对统计

2．2 测序质量评估

2．3 测序饱和度分析

2．4 Reads在参考基因上的分布统计

2．5 基因覆盖度统计

2．6 qRT-PCR分析验证

2．7 差异表达基因的筛选

2．8 Gene Ontology功能分析

2．9 生物途径显著性分析

2．10 植物激素和信号转导

2．11 转录因子

2．12 苯丙素代谢

3 讨论

第五章 不育系与保持系花药的代谢组比较分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 GC-MS结果与分析

2．2 LC-MS结果与分析

3 讨论

第六章 转录组与代谢组整合分析

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 碳水化合物代谢途径转录组代谢组整合分析

2．2 次级代谢途径转录组代谢组整合分析

2．3 qRT-PCR分析验证

3 讨论

第七章 线粒体反向调控途径中可能的信号分子的荧光检测

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 活性氧荧光检测

2．2 活性氮荧光检测

2．3 钙离子荧光检测

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢