生防细菌对桃和枇杷果实采后病害的生物防治及其机理研究

摘要

水蜜桃和枇杷果实因其营养丰富、味道鲜美而深受广大消费者喜爱。根霉菌(Rhizopusstolonifer)引起的桃软腐病和由炭疽茵（Colletotrichumacutatum）引起的枇杷炭疽病是这两种水果采后运输和贮藏过程中的主要病害，可造成巨大的经济损失。因此，防止水蜜桃和枇杷果实在贮运过程中病原菌的侵染，减少采后腐烂损失，是水蜜桃和枇杷果实采后迫切需要解决的重要问题。传统的水果保鲜除了采用低温和气调延缓自身的后熟衰老以保持天然抗病性外，还必须依靠化学杀菌剂控制贮藏病害的发生;随着人们对食品安全和环境保护的日益重视，一些原先用于果实采后防腐处理的化学杀菌剂已被陆续禁止使用，迫切需要研究探索非杀菌剂型的果实病害控制新方法。生防茵剂的使用可以有效的减少化学农药的使用量和由此带来的环境污染，有利于农产品的食用安全。生物菌剂对环境友好，是毒性化学农药的补充或替代。近年来，越来越多的生防茵剂被应用于农业生产。
　　生防茵蜡质芽孢杆菌BacilluscereusAR156和枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSM21对于多种病原茵具有广谱的生防效果。它们被广泛应用于防治蔬菜青枯病、斑点病及根结线虫等，但对果实采后病害防治的作用尚未见报道。本论文以典型的跃变型果实水蜜桃和非跃变型果实枇杷为试材，研究B.cereusAR156、B.subtilisSM21及其混合菌剂对桃果实采后软腐病和枇杷果实采后炭疽病的防治效果，对抗病相关酶活性和H2O2代谢相关酶活性以及抗病相关基因的表达的影响，以揭示这两种生防菌降低桃果实软腐病和枇杷炭疽病发生的可能机理，以期为生防菌处理在桃和枇杷果实采后贮运中的应用提供理论依据。研究结果分述如下:
　　(1)B.cereusAR156处理桃果实能够降低由R.stolonifer引起的软腐病发病率，并显著抑制果实的病斑扩展。体外研究表明，B.cereusAR156也能够抑制R.stolonifer菌丝的扩展，但抑制作用不明显。B.cereusAR156诱导H2O2和总酚的积累，诱导几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、PAL、POD等抗病相关酶活性的上升，从而提高果实的抗病性。基因表达结果表明，只有当AR156处理桃果实并接种R.stolonifer后，抗病相关基因PpNPR1-like、PpPR-like、PpCHI和PpGNS快速而大量的表达。这些结果说明，B.cereusAR156是通过priming机制来诱导果实抗病性的。
　　(2)对B.subtilisSM21处理对桃软腐病的抑制作用及其机理进行了研究。结果发现B.subtilisSM21能显著抑制果实的发病率和病斑扩展。体外研究表明，SM21可以显著抑制R.stolonifer菌丝的扩展。B.subtilisSM21处理可以诱导抗病相关酶几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、OAL和POD的酶活性，促进总酚、H2O2等抗病相关物质的合成，上调七个抗病相关基因的表达。这些结果表明，b.subtilisSM21处理抑制桃果实软腐病的机理主要是直接诱导了果实的抗病性，另外，SM21抑制了菌丝的扩展可能也是SM21能够抑制果实发病率的一个原因。
　　(3)B.cereusAR156和B.subtilisSM21的混合菌剂处理比单一菌剂处理更为有效地抑制了桃果实软腐病的发病率和病斑直径，从而更显著地抑制了桃果实腐烂的发生。体外研究表明，混合菌剂可以有效地抑制R.stolonifer菌丝的扩展。同时，混合菌剂处理较单一处理在整个贮藏过程中更为有效地诱导了桃果实中几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、PAL和POD活性以及总酚含量的上升，从而提高了果实抗病性。此外，混合菌剂处理保持了较高的H2O2含量和DPPH自由基清除能力。因此，相比单一菌剂处理，混合菌剂处理更为显著地抑制了桃果实采后腐烂的发生。
　　(4)B.cereusAR156处理对枇杷果实采后炭疽病有很好的防治效果。B.cereusAR156处理诱导了几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、PAL和POD等抗病相关酶活性和总酚含量、几丁质酶含量的上升，维持了活性氧代谢的平衡，诱导了抗病相关基因的表达，从而提高了果实的抗病性。AR156处理没有影响枇杷果实的品质，反而增加了枇杷果实的氨基酸、可溶性糖和有机酸的含量。这些结果可以推断AR156抑制枇杷炭疽病的机理主要是通过诱导果实的priming反应从而提高了果实的抗病性。
　　(5)B.subtilisSM21处理能有效抑制采后枇杷炭疽病的发生，维持了果实的TSS和TA含量，提高了枇杷果实氨基酸含量、可溶性糖含量和有机酸含量。SM21处理诱导了几丁质酶的合成。同时，SM21还诱导了果实总酚和H2O2含量的上升和DPPH自由基清除能力，并且直接诱导了抗病相关酶活性的上升，维持了活性氧代谢的平衡。这说明SM21处理抑制枇杷采后炭疽病主要是通过直接诱导果实的抗病性来起作用的。
　　(6)研究了B.cereusAR156和B.subtilisSM21的混合茵剂处理对枇杷采后炭疽病的防治效果及其防治机理。研究发现，混合菌剂处理比单一菌剂处理更为有效地抑制了炭疽病病斑直径的扩展。混合菌剂在抗病的同时，维持了果实的氨基酸、可溶性糖和可滴定酸含量。混合菌剂处理较单一茵剂处理在贮藏过程中更为有效地诱导了枇杷果实中几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、PAL、POD活性以及总酚含量的上升，从而提高了枇杷果实的抗病性。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 生物防治在水果采后病害防控中的应用

1．1 水果采后病害防控中的生防措施

1．2 生物防治的作用机理

2 Priming在食品保鲜及食品作物生产中的作用

2．1 Priming的定义、发生过程和作用机制

2．2 Priming在食品作物抗性诱导和病害防治中的重要作用

2．3 Priming对提高食品作物品质的作用

2．4 Priming的应用展望

3 立题背景及主要研究内容

3．1 立题背景

3．2 主要研究内容

第二章 生防蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus AR156对桃果实采后软腐病的防治效果及机理研究

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 硬度、可溶性固形物和可滴定酸的测定

1．3 B.cereus AR156对R．stolonifer的体外抑制作用

1．4 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．5 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．6 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定和H2O2含量的测定

1．7 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的测定

1．8 总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．9 抗病相关基因的表达

1．10 数据处理

2 结果与分析

2．1 B．cereus AR156处理对桃果实发病率和病斑直径的影响

2．2 B．cereus AR156处理对桃果实品质的影响

2．3 B．cereus AR156对R．stolonifer的体外抑菌效果

2．4 B．cereus AR156处理对桃果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影面

2．5 B．cereus AR156处理对桃果实SOD、CAT、APX活性和H2O2含量的影响

2．6 B．cereus AR156处理对桃果实POD、PAL、PPO活性的影响

2．7 B．cereus AR156处理对桃果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的影响

2．8 B．cereus AR156处理对桃果实抗病相关基因表达的影响

3 讨论

4 本章小结

第三章 生防枯草芽孢杆菌B．subtilis SM21对桃果实采后软腐病的防治效果及机理研究

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 硬度、可溶性固形物和可滴定酸的测定

1．3 B．subtilis SM21对R．stolonifer的体外抑制作用

1．4 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．5 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．6 SOD、CAT、APX活性的测定和H2O2含量的测定

1．7 PAL、POD和PPO活性的测定

1．8 总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．9 抗病相关基因的表达

1．10 数据处理

2 结果与分析

2．1 B．subtilis SM21处理对桃果实发病率和病斑直径的影响

2．2 B．subtilis SM21处理对桃果实品质的影响

2．3 B．subtilis SM21对R．stolonifer的体外抑菌效果

2．4 B．subtilis SM21处理对桃果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响

2．5 B．subtilis SM21处理对桃果实SOD、CAT、APX活性和H2O2含量的影响

2．6 B．subtilis SM21处理对桃果实POD、PAL、PPO活性的影响

2．7 B．subtilis SM21处理对桃果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的

2．8 B．subtilis SM21处理对桃果实抗病相关基因表达的影响

3 讨论

4 本章小结

第四章 B．cereus AR156和B．subtilis SM21的混合菌剂对桃果实采后软腐病的影响

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 混合菌剂对R．stolonifer的体外抑制作用

1．3 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．4 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．5 SOD、CAT、APX活性的测定和H2O2含量的测定

1．6 PAL、POD和PPO活性的测定

1．7 总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．8 数据处理

2 结果与分析

2．1 混合菌剂处理对桃果实发病率和病斑直径的影响

2．2 混合菌剂处理对R．stolonifer的体外抑菌效果

2．3 混合菌剂处理对桃果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响

2．4 混合菌剂处理对桃果实SOD、CAT、APX活性和H2O2含量的影响

2．5 混合菌剂处理对桃果实PAL、POD和PPO活性的影响

2．6 混合菌剂处理对桃果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的影响

3 讨论

4 本章小结

第五章 生防蜡质芽孢杆菌B．cereus AR156对枇杷果实采后炭疽的防治效果及机理研究

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 硬度、可溶性固形物和可滴定酸的测定

1．3 氨基酸含量的测定

1．4 可溶性糖和有机酸的测定

1．4 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．6 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．7 SOD、CAT、APX活性的测定和H2O2含量的测定

1．8 PAL、POD和PPO活性的测定

1．9 总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．10 抗病相关基因的表达

1．11 几丁质酶含量的测定

1．12 数据处理

2 结果与分析

2．1 B．cereus AR156处理对枇杷果实发病率和病斑直径的影响

2．2 B．cereus AR156处理对枇杷果实品质的影响

2．3 B．cereus AR156处理对枇杷果实氨基酸含量的影响

2．4 B．cereus AR156处理对枇杷果实可溶性糖和有机酸含量的影响

2．5 B．cereus AR156处理对枇杷果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响

2．6 B．cereus AR156处理对枇杷果实SOD、CAT、APX活性和H2O2含量的影响

2．7 B．cereus AR156处理对枇杷果实PAL、POD和PPO活性的影响

2．8 B．cereus AR156处理对枇杷果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的影响

2．9 B．cereus AR156处理对枇杷果实抗病相关基因表达的影响

2．10 B．cereus AR156处理处理对枇杷果实几丁质酶含量的影响

3 讨论

4 本章小结

第六章 生防枯草芽孢杆菌B．subtilis SM21对枇杷果实采后炭疽的防治效果及机理研究

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 硬度、可溶性固形物和可滴定酸的测定

1．3 氨基酸含量的测定

1．4 可溶性糖和有机酸的测定

1．5 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．6 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．7 SOD、CAT、APX活性的测定和H2O2含量的测定

1．8 PAL、POD和PPO活性的测定

1．9 总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．10 抗病相关基因的表达

1．11 几丁质酶含量的测定

1．12 数据处理

2 结果与分析

2．1 B．subtilis SM21处理对枇杷果实发病率和病斑直径的影响

2．2 B．subtilis SM21处理对枇杷果实品质的影响

2．3 B．subtilis SM21处理对枇杷果实氨基酸含量的影响

2．4 B．subtilis SM21处理对枇杷果实可溶性糖和有机酸含量的影响

2．5 B．subtilis SM21处理对枇杷果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响

2．6 B．subtilis SM21处理对枇杷果实SOD、CAT、APX活性和H2O2含量的影响

2．7 B．subtilis SM21处理对枇杷果实PAL、POD和PPO活性的影响

2．8 B．subtilis SM21处理对枇杷果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的影响

2．9 B．subtilis SM21处理对枇杷果实抗病相关基因表达的影响

2．10 B．subtilis SM21处理处理对枇杷果实几丁质酶含量的影响

3 讨论

4 本章小结

第七章 B．cereus ARl56和B．subtilis SM21的混合菌剂对枇杷果实采后炭疽病的影响

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 氨基酸含量的测定

1．3 可溶性糖和有机酸的测定

1．4 粗酶液的提取和蛋白质含量的测定

1．5 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

1．6 PAL、POD和PPO活性的测定

1．7总酚含量和DPPH自由基清除能力的测定

1．8 几丁质酶含量的测定

1．9 数据处理

2 结果与分析

2．1 混合菌剂处理对枇杷果实发病率和病斑直径的影响

2．2 混合菌剂处理对枇杷果实氨基酸含量的影响

2．3 混合菌剂处理对枇杷果实可溶性糖和有机酸含量的影响

2．4 混合菌剂处理对枇杷果实几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响

2．5 混合菌剂处理对枇杷果实PAL、POD和PPO活性的影响

2．6 混合菌剂处理对枇杷果实总酚含量和DPPH自由基清除能力的影响

2．7 混合菌剂处理对枇杷果实几丁质酶含量的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文总结

论文创新点

攻读博士学位期间发表的论文

致谢