野生大豆染色体片段代换系群体中斜纹夜蛾抗性、叶片茸毛密度相关QTL/片段的定位及茸毛发育相关基因GmTTG1的克隆

摘要

大豆(Glycine max(L.) Merr.)，起源于我国，是当今世界最重要的经济作物之一，富含植物油脂和植物蛋白，与人类的生活息息相关。斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)是我国主要的大豆害虫之一，近年来爆发频率和为害面积呈不断上升的趋势。因此培育抗斜纹夜蛾的大豆新品种已成为当务之急。研究表明，作物茸毛的不同性状，如直立程度、密度、长度、颜色等与其对某些害虫的抗性存在密切关系。以茸毛性状作为指示性状来指导抗虫性资源的筛选和育种已得到了广泛地应用。
　　本研究以野生大豆染色体片段代换系群体SojaCSSLP1为材料，分别定位与斜纹夜蛾抗性以及叶片茸毛密度、长度相关的QTL/片段，并分析大豆对斜纹夜蛾的抗性与叶片茸毛密度、长度之间的相关性。同时本研究还以栽培大豆南农1138-2为材料克隆了控制茸毛发育的关键基因GmTTG1，进而构建植物过表达载体，并进行相应的生物信息学分析。主要结果如下:
　　(1)本研究以野生大豆染色体片段代换系群体SojaCSSLP1为材料，采用室内饲喂斜纹夜蛾幼虫的方法，分别以幼虫重(LW)和蛹重(PW)为抗生性鉴定指标，定位与斜纹夜蛾抗性相关的QTL/片段。以幼虫重为指标，检测到3个与斜纹夜蛾抗性相关的野生片段，它们分别是Sat351、Satt126和Sat105，对应的加性QTL/片段分别为qLW-2-1、qLW-14-1和qLW-20-1，贡献率(PVE)分别为8.7％、7.4％和4.8％，来自于野生大豆的片段全部表现为减效（抗虫）作用。同时，本研究还定位到10对上位性QTL/片段，贡献率为8.2％-15.7％，其中有5对表现为增效（感虫）作用，它们分别是(Sat_351，Sat_356)、(Sat_351,Sat_336)、(Sat_351,Satt160)、(Satt414,Sat_105)和(Satt135,Sat_105);另外5对表现为减效（抗虫）作用，它们分别是(Sat_351，Satt168)、(Sat_351，Sat066)、(Sat_351，Satt063)、(Sat_351，Sat_424)和(Sat_351，Satt135)。上述定位结果共涉及12个位点，通过对亲本和差异家系在上述位点的基因型进行分析，初步判断SojaCSSLP1群体所表现的感虫性是在加性效应和上位性效应的共同作用下，通过不同效应的综合累加造成的。以蛹重为指标检测到1个与大豆对斜纹夜蛾抗性相关的野生片段Satt491，对应的加性QTL/片段为qPW-15-1，贡献率(PVE)为4.2％,该野生片段表现为减效（抗虫）作用。由此可见，室内条件下，野生大豆对斜纹夜蛾的抗性是一个复杂遗传的性状。
　　(2)本研究以染色体片段代换系群体SojaCSSLP1为材料，检测到5个与大豆叶片茸毛密度相关的野生片段，它们分别是Sct_195、GMABAB、Sct_190、Sat_411和Satt434，对应的加性QTL/片段分别为qPD-3-1、qPD-3-2、qPD-9-1、qPD-11-1和qPD-12-1，贡献率(PVE)分别为2.6％、6.2％、4.4％、4.8％和3.4％，且来自野生大豆的片段全部表现为增加叶片茸毛密度的正效应;本试验未检测到与大豆叶片茸毛长度相关的QTL/片段。同时，试验结果显示大豆叶片茸毛密度、长度与大豆对斜纹夜蛾的抗生性并不相关。因此，对SojaCSSLP1群体来说，叶片茸毛密度和长度不能作为筛选抗斜纹夜蛾家系和标记辅助育种的指示性状。
　　(3)本研究通过对NCBI的检索获得了拟南芥AtTTG1的氨基酸序列，然后以AtTTG1的氨基酸序列为参考在Phytozome数据库中对大豆的全基因组进行BLASTP，获得了四个高度同源的GmTTG1基因，并分别命名为GmTTG1a、GmTTG1b、GmTTG1c、GmTTG1d，分别位于四条不同的染色体上。之后以大豆品种南农1138-2为材料，通过同源克隆获得了大豆GmTTG1a的cDNA全长基因，并利用Gateway技术构建了植物过表达载体pMDC83-GmTTG1。利用生物信息学方法对GmTTG1的基因结构、同源性和系统进化以及蛋白质结构进行了预测分析。结果显示大豆GmTTG1与拟南芥AtTTG1的基因结构类似;蛋白质结构预测分析显示四个大豆GmTTG1蛋白的理化性质相似，均为亲水性蛋白，不存在跨膜结构域和信号肽，不属于分泌蛋白，含有丰富的磷酸化位点，最有可能定位于细胞质内，只含有极少量的卷曲螺旋结构，二级结构和三级结构十分相似。生物信息学的分析结果还显示大豆GmTTG1基因出现了两个分支，其中GmTTG1a和GmTTG1b比较接近，而GmTTG1c和GmTTG1d更为接近。推测是由于大豆基因组在进化过程中至少发生了两次复制，从而使得整个基因组高度重复，并导致了基因的冗余和丢失。在这一过程中，大豆GmTTG1基因发生了趋异进化，从而导致了各拷贝间的差异。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 大豆抗虫性研究进展

1．1 大豆主要害虫的种类及危害

1．2 大豆抗虫性资源的鉴定与筛选

1．3 大豆抗虫性机制

1．4 大豆抗虫性与茸毛着生状态的关系

1．5 大豆抗虫性遗传与抗虫育种

1．6 大豆抗虫性的QTL定位及抗虫基因工程

2 野生大豆研究进展

2．1 野生大豆的形态特征

2．2 野生大豆的分布

2．3 野生大豆的主要优异性状

2．4 野生大豆资源的利用

3 染色体片段代换系(CSSLs)研究进展

3．1 染色体片段代换系的构建原理

3．2 染色体代换片段的鉴定方法

3．3 染色体代换片段长度的估算方法

3．4 染色体片段代换系的QTL定位方法

3．5 染色体片段代换系的应用

4 植物茸毛分子研究进展

4．1 拟南芥茸毛发育过程

4．2 控制茸毛发育的关键基因

4．3 茸毛发育的调控模式

5 本研究目的和意义

第二章 大豆对斜纹夜蛾抗性的相关QTL／片段定位

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 幼虫重和蛹重的表型变异

2．2 QTL／片段定位

3 小结与讨论

第三章 大豆叶片茸毛性状的相关QTL／片段定位及其与斜纹夜蛾抗性的相关性分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 叶片茸毛性状的表型变异

2．2 QTL／片段定位

2．3 大豆叶片茸毛性状与斜纹夜蛾抗性的相关性分析

3 小结与讨论

第四章 大豆GmTTG1基因的克隆、过表达载体的构建和生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 试验材料与仪器

1．2 试验方法

1．3 大豆GmTTG1α基因的克隆

1．4 植物过表达载体pMDC83-GmTTG1的构建

1．5 大豆GmTTG1基因的生物信息学分析

2 结果与分析

2．1 大豆总RNA提取与反转cDNA结果检测

2．2 大豆GmTTG1α基因的克隆

2．3 BP反应与LR反应结果检测

2．4 大豆GmTTG1基因的生物信息学分析

3 小结与讨论

第五章 全文总结及创新点

1 全文主要结论

2 主要创新点

参考文献

附录

致谢