鱼源无乳链球菌透明质酸酶和金属蛋白酶基因缺失株构建及特性分析

摘要

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），又称B族链球菌(group B streptococci，GBS)，是一种重要的人-兽-鱼共患的病原菌。近年来，鱼源无乳链球菌导致大规模罗非鱼死亡，严重影响了我国罗非鱼产业的发展，造成了水产养殖业巨大的经济损失。研究发现，鱼源无乳链球菌比其他水生环境的病原菌具有更强的传染性，并且对鱼类可达到100％的致死率。因此，对无乳链球菌致病性及致病机理的研究对于防控鱼类链球菌病至关重要。
　　1鱼源无乳链球菌透明质酸酶hylB基因的克隆表达及抗原性分析
　　透明质酸酶(HylB)是无乳链球菌分泌的蛋白水解酶，是该菌重要的毒力因子。根据实验室分离并公布在GenBank上的罗非鱼源无乳链球菌全基因组序列，PCR扩增获得长为2346bp，覆盖保守功能区的hylB基因片段。将该片段采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化后亚克隆至表达载体pET28a(+)，经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行体外原核表达，获得88.5ku的目的蛋白。将纯化后的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，经ELISA和Western blot鉴定该蛋白具有良好的免疫原性。
　　2鱼源无乳链球菌hylB及mp基因缺失株的构建
　　根据鱼源无乳链球菌GD201008-001株的基因组，分别设计hylB和mp基因上下游引物，扩增目的基因上下游片段，通过融合PCR方法融合扩增上下游同源臂。将上下游同源臂连接至链球菌-大肠杆菌温度敏感型自杀质粒pSET-4s。通过电击转化将自杀性质粒转入GD201008-001株进行同源重组，通过抗性筛选出双交换后的hylB基因和mp基因缺失株，并进行常规PCR及荧光定量PCR鉴定。将含有启动子的目的基因片段连入pSET-2穿梭质粒，再转入缺失株，PCR检测基因为阳性的即为互补株。试验成功构建了hylB基因和mp基因的缺失株及互补株，为进一步的生物学特性分析奠定了基础。
　　3鱼源无乳链球菌hylB和mp基因缺失株的特性分析
　　为进一步研究无乳链球菌GD201008-001株HylB和Mp蛋白的功能，试验比较了hylB和mp基因的缺失株、互补株和野生株在生物体内外的特性差异。结果发现，hylB及mp基因缺失株、互补株和野生株生长曲线均无明显差异。mp基因缺失株对斑马鱼的LD50上升，在小鼠血液和脑部定殖数下降;在巨噬细胞内存活的能力随着时间变化呈下降趋势;缺失株培养上清对Bend.3细胞毒性下降明显。以上研究结果揭示Mp蛋白是无乳链球菌重要的毒力因子，在无乳链球菌抵制宿主巨噬细胞吞噬并存活的过程中发挥重要作用。hylB基因缺失株的生物学特性分析发现，与野生株和互补株相比，缺失株不能利用透明质酸为细菌生长提供碳源，对斑马鱼的LD50上升明显，在小鼠血液、脾脏和脑部定殖数下降，在巨噬细胞内的存活能力随着时间变化下降明显，且感染小鼠脾脏及巨噬细胞引起促炎因子表达能力显著升高，对Bend.3细胞的毒性及黏附能力下降。研究结果表明无乳链球菌HylB蛋白有助于细菌在动物及巨噬细胞内的存活，同时影响巨噬细胞促炎性细胞因子的表达，在无乳链球菌致病过程中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

前言

第一章 无乳链球菌致病性及致病机制的研究进展

1 无乳链球菌的分类地位及生物学特性

2 无乳链球菌致病性

2．1 对水产动物的致病性

2．2 对奶牛的致病性

2．3 对人的致病性

3 无乳链球菌致病机理

4 无乳链球菌主要的毒力因子

4．1 荚膜多糖

4．2 β-溶血素

4．3 CAMP因子

4．4 C5a肽酶

4．5 纤维蛋白原结合蛋白

4．6 富色氨酸重复序列蛋白

4．7 透明质酸酶

5 无乳链球菌与宿主细胞互作机制

5．1 与巨噬细胞的互作

5．2 与微脑血管内皮细胞的互作

参考文献

第二章 鱼源无乳链球菌透明质酸酶hylB基因的克隆表达及抗原性分析

1 材料与方法

1．1 菌株、质粒和实验动物

1．2 仪器和试剂

1．3 方法

2 结果

2．1 hylb基因序列分析及原核表达载体的构建

2．2 HylB蛋白在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

2．3 重组的HylB蛋白免疫原性分析

3 讨论

参考文献

第三章 鱼源无乳链球菌GD201008-001株的hylB及mp基因缺失株的构建

1 材料与方法

1．1 菌株、质粒与引物

1．2 仪器和试剂

1．3 hylB和mp基因缺失载体的构建

1．4 hylB和mp基因缺失株的构建

1．5 基因互补株的构建

1．6 缺失株和互补株的荧光定量PCR鉴定

1．7 遗传稳定性分析

2 结果

2．1 无乳链球菌hylB和mp基因缺失株与互补株的构建与鉴定

2．2 荧光定量PCR分析hylB及mp基因的表达

2．3 遗传稳定性分析

3 讨论

参考文献

第四章 鱼源无乳链球菌GD201008-001株hylB和mp基因缺失株的特性分析

1 材料与方法

1．1 菌株及引物

1．2 细胞及实验动物

1．3 试剂和仪器

1．4 特性分析

2 结果

2．1 生长曲线

2．2 利用HA生长的能力

2．3 对斑马鱼的LD50

2．4 感染小鼠组织中的细菌载量

2．5 巨噬细胞内的存活能力

2．6 小鼠巨噬细胞及脾脏促炎性细胞因子的表达

2．7 对Bend．3细胞的黏附能力

2．8 对RAW264．7细胞及Bend．3细胞的毒性

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢