母猪低蛋白日粮通过myostatin通路影响断奶仔猪骨骼肌生长的机制

摘要

母体营养对子代骨骼肌影响的研究已有很多，迄今研究主要集中在妊娠和/或哺乳期间母体限饲或低蛋白日粮对子代肌纤维生长发育、肌纤维分型及肌纤维蛋白代谢的影响等方面。近年来的研究表明，妊娠期和哺乳期母体饲喂低蛋白日粮可以影响血液胰岛素和氨基酸水平，以及肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）通路。然而，母体低蛋白是否影响仔猪骨骼肌肉发生、肌细胞增殖、凋亡等相关基因的表达还不是很清楚。有研究显示，母体低蛋白日粮可以影响MSTN在骨骼肌中的表达。本实验主要研究母猪在两个时期（妊娠期和哺乳期）饲喂低蛋白日粮是否对其断奶仔猪血液中氨基酸、尿素氮、总蛋白和胰岛素等激素含量产生影响，是否对骨骼肌发生、肌细胞增殖、凋亡相关基因表达产生影响，并通过何种机制调控MSTN的表达。
　　1母体日粮蛋白水平对断奶仔猪表观指标以及生长相关基因的影响
　　本实验选用二胎二元长大杂交母猪共16头。将实验动物随机分为标准蛋白(SP)组和低蛋白(LP)组。在妊娠和哺乳期给母猪饲喂含粗蛋白不同但能量相同的饲料。在妊娠期，标准蛋白组饲喂粗蛋白含量为15％的日粮，低蛋白组饲喂粗蛋白为7.5％的日粮。在哺乳期，SP组饲喂粗蛋白含量为18％的日粮，LP组喂粗蛋白含量为9％的日粮。分娩之后，为避免实验以外其他因素的影响，将每窝仔猪都调整为7～8只。在分娩28 d后，对仔猪进行断奶，每窝猪中选取一只雄性仔猪进行样品采集。采样前称量仔猪的体重。检测血清中游离氨基酸、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、皮质醇、尿素氮和总蛋白水平;检测背最长肌RNA、DNA、蛋白的浓度和含量。结果显示:断奶仔猪低蛋白组的体重、背最长肌肌肉重、肌肉蛋白含量以及血液氨基酸、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、皮质醇含量与标准蛋白组相比均无显著差异，但LP组的断奶仔猪血清中尿素氮水平和总蛋白水平显著降低(P＜0.05);LP组仔猪，背最长肌中RNA浓度、RNA含量和蛋白浓度显著低于标准蛋白组（P＜0.05），DNA含量有降低趋势(P＜0.1)。母猪饲喂低蛋白日粮影响了其仔猪血清中尿素氮、总蛋白含量以及背最长肌核酸含量，提示，母猪低蛋白日粮可能对子代机体代谢和骨骼肌细胞生长产生影响。
　　为了探讨母体低蛋白日粮影响子代骨骼肌生长发育的分子机制，用Real-timePCR检测了肌肉肌肉生长(IGFs、mTOR)、增殖(PCNA、CCND2)、凋亡(Bcl、Bax)和蛋白水解（Atrogin1、MuRF1）等基因的表达。发现，LP组断奶仔猪骨骼肌中IGF2R的基因表达有升高趋势(P＜0.1)，增殖相关基因CCND2的基因表达有降低趋势(P＜0.1)，但对其余生长、增殖、凋亡以及蛋白降解相关基因的表达无显著影响。这个结果说明，母体低蛋白日粮可能不直接通过影响子代骨骼肌中这些基因的表达影响骨骼肌的生长。
　　2母猪低蛋白日粮对仔猪背最长肌MSTN通路的影响及调控机制
　　运用Real-time PCR检测了肌肉发育相关基因进一步检测了肌肉发生相关基因（MSTN、MyoD、Myf5、Myf6、MEF2和Myogenin）的表达，结果发现母体低蛋白日粮除了显著升高MSTN基因表达之外并没有影响其余肌肉发生相关基因的表达。于是又检测了MSTN的两个受体ACVR2B和ALK5的基因表达，同时运用Westernblotting方法检测了MSTN下游信号通路上的ERK、p38-MAPK和JNK的磷酸化蛋白表达。结果发现，LP组仔猪背最长肌中ACVR2B和ALK5的基因表达并无显著变化，但p38-MAPK磷酸化水平显著升高(P＜0.05)。提示，母体低蛋白可能通过MSTN及其下游p38-MAPK通路影响子代骨骼肌生长。此外，为了探讨MSTN的转录调控机制，运用Real-time PCR和Western blotting的方法检测了转录因子(FoxO3、FoxO4、GR和PGC1α)的表达。结果发现，低蛋白组断奶仔猪骨骼肌中FoxO4的基因表达显著升高(P＜0.05)，FoxO3和GR的基因表达有升高趋势(P＜0.1)，PGC1α的基因表达无显著变化。Western blotting的方法检测发现，FoxO3的蛋白表达显著升高(P＜0.05)，其余转录因子蛋白表达无显著变化。为了探讨FoxO3和GR是否参与MSTN的基因转录调控，采用染色质免疫共沉淀（ChIP）的方法检测FoxO3和GR与MSTN启动子区的结合情况。结果发现，LP断奶仔猪骨骼肌GR与MSTN启动子区的一个预测结合位点的结合显著升高(P＜0.05)，另一个预测结合位点的结合有升高趋势(P＜0.1)。此外，LP组断奶仔猪骨骼肌FoxO3与MSTN启动子的预测结合位点结合显著升高(P＜0.05)。以上结果提示:母体低蛋白日粮可能通过MSTN及其下游p38-MAPK信号通路影响子代骨骼肌生长，并且FoxO3和GR参与了MSTN的转录调控。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 骨骼肌生长的调控

1 骨骼肌的早期发育

1．1 骨骼肌细胞的分化

1．2 骨骼肌早期发育的阶段性

1．3 骨骼肌早期发育的影响因素

1．4 骨骼肌发生相关基因家族

1．5 骨骼肌生长相关基因

1．6 骨骼肌细胞凋亡相关基因

1．7 蛋白降解相关基因

2 母体营养对子代骨骼肌早期发育的影响

2．1 母体营养对后代肌肉发生及生长的影响

2．2 母体营养对后代骨骼肌纤维类型的影响

第二章 MYOSTATIN的功能、信号通路与转录调控

1 MSTN在骨骼肌生长、发育中的作用

1．1 MSTN对骨骼肌的作用

1．2 MSTN的作用机理

2 MSTN的信号通路

2．1 MSTN受体

2．2 MAPK通路

2．3 Smad通路

3 MSTN的基因转录调控

第三章 母猪低蛋白日粮对子代背最长肌重量、血清中游离氨基酸和胰岛素含量的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 母猪日粮蛋白水平对子代背最长肌肌肉发生相关基因的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文情况

附录