大鲵细菌病原的分离鉴定与嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫应答研究

摘要

中国大鲵（Andrias davidianus），俗称娃娃鱼，为我国特有珍稀两栖动物，主要分布于四川、湖北、湖南、贵州、陕西等省份，已列入国家二级保护动物名录，并被列入CITES公约附录Ⅰ中。近些年，各地相继对大鲵人工繁殖和养殖技术展开了研究，推动了全国大鲵养殖业的快速发展。然而，随着大鲵养殖规模的不断扩大及养殖集约化程度的不断提高，大鲵病害问题日趋严重，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。
　　本研究取患病濒死大鲵肝脏分离细菌，利用Biolog微生物鉴定系统及16SrDNA序列分析对纯培养细菌进行鉴定，然后进行健康大鲵人工感染试验，通过其病征及病原菌再分离鉴定确定病原菌，同时对该病原菌进行药物敏感试验。从患病濒死大鲵肝脏中分离到一株病原菌YZ01，经Biolog微生物鉴定系统的鉴定及16S rDNA序列的系统发育分析表明，该病原菌为类志贺邻单胞菌，且通过人工感染试验，可致健康大鲵与自然患病大鲵相同的症状并再次分离到该病原菌。药物敏感试验表明，该菌株对头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素和头孢呋辛等18种药物敏感。
　　本研究以福尔马林灭活的大鲵嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH)，通过腹腔注射免疫健康大鲵，分别于免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品，进行大鲵外周血液的血细胞计数与白细胞组成分析，测定吞噬细胞的吞噬活性以及血清中和抗体效价，于免疫28天后进行攻毒感染试验。结果表明:与对照组相比，在免疫后第4、7、14和第21天，免疫大鲵外周血中血细胞数量显著增加，其中，红细胞和白细胞数量均于第4天达峰值，分别为7.83×107个/ml和6.74×106个/ml;嗜中性粒细胞百分比在第4天达峰值，为28.60％，单核细胞百分比在第7天达峰值，为10.53％;吞噬细胞活性显著提高，且吞噬百分比和吞噬指数均在第4天达到最高值，分别为34.09％和3.73。随后，淋巴细胞百分比和中和抗体效价显著增加，均在第21天达峰值，分别为75.30％和1∶426.67。攻毒感染试验结果表明，免疫组的相对免疫保护率为69.23％。由此可见，F-AH免疫原能够通过促进免疫大鲵血细胞数量的增加、吞噬细胞吞噬活性的提高以及特异性抗体的产生等方式提高鱼体的免疫保护力。
　　本研究比较分析了不同免疫佐剂对大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗的增效作用。取已制备好的大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗，分别加入蜂胶佐剂、弗氏佐剂和铝胶佐剂，充分混匀后制备成含菌量为1×108cfu/ml的佐剂疫苗，通过腹腔注射免疫健康大鲵，每尾1ml，并设不加佐剂组和对照组。分别于免疫后第1、4、7、14、21、28和35天，尾静脉采血，利用凝集反应检测血清抗体效价。于免疫35天后进行攻毒感染试验。结果表明:与对照组相比，蜂胶佐剂组抗体效价于免疫后第21天达最高，为1∶469.33，弗氏佐剂组最高达1∶448，铝胶佐剂组抗体效价于免疫后第28天达到最大值，为1∶362.67，而不加佐剂组最高为1∶384。攻毒感染试验结果表明，蜂胶佐剂组、弗氏佐剂组、铝胶佐剂组和不加佐剂组的免疫保护率分别为88.9％、77.8％、72.2％和61.1％。由此可见，3种佐剂疫苗均有较好的免疫保护效果，其中以蜂胶佐剂疫苗效果最佳。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 中国大鲵

1．1 大鲵资源

1．2 大鲵的生物学特性

1．3 大鲵的价值及养殖现状

2 大鲵病害研究进展

2．1 大鲵细菌性疾病

2．2 大鲵真菌性疾病

2．3 大鲵寄生虫疾病

2．4 大鲵病毒性疾病

2．5 大鲵非寄生性疾病

3 血液指标研究

3．1 血细胞参数

3．2 酶学指标

4 疫苗免疫佐剂的应用研究

4．1 铝盐佐剂

4．2 油乳佐剂

4．3 蜂胶佐剂

4．4 微生物佐剂

4．5 分子佐剂

4．6 其他佐剂

5 研究目的和意义

第二章 患病大鲵类志贺邻单胞菌的分离与鉴定

1 材料及方法

1．1 材料

1．2 病原菌分离及培养

1．3 人工感染试验

1．4 Biolog微生物自动鉴定仪

1．5 16S rDNA序列的扩增与测序

1．6 序列分析与系统发育树的构建

1．7 药敏试验

2 结果

2．1 病原菌的菌落形态特征

2．2 人工感染试验

2．3 Biolog微生物自动鉴定

2．4 序列分析与系统发育树的构建

2．5 药敏试验

3 讨论

第三章 嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化研究

1 材料与方法

1．1 试验大鲵与暂养

1．2 供试菌株及其培养

1．3 免疫原与吞噬原的制备

1．4 灭活疫苗的安全性试验

1．5 免疫与采血

1．6 免疫指标检测

1．7 攻毒感染试验

1．8 实验数据分析

2 结果

2．1 无菌检验与鱼体安全性试验

2．2 血细胞计数

2．3 白细胞分类计

2．4 吞噬细胞吞噬活性

2．5 血清抗体效价

2．6 相对免疫保护力

3 讨论

第四章 不同佐剂对大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫效果的比较研究

1 材料与方法

1．1 菌种来源

1．2 试验动物

1．3 免疫原的制备

1．4 灭活疫苗的安全性试验

1．5 佐剂疫苗制备

1．6 免疫与采血

1．7 血清抗体效价检测

1．8 攻毒感染试验

2 结果

2．1 疫苗无菌检验与安全性试验

2．2 血清凝集抗体效价

2．3 相对免疫保护力

3 分析与讨论

总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文