PCV2通过激活MyD88-NF-κB信号途径调节体外培养仔猪淋巴细胞IL-4和IL-12的分泌

摘要

研究猪圆环病毒2型（porcine circovirus2，PCV2）对仔猪淋巴细胞分泌IL-4和IL-12动态影响及其调控的信号途径，旨在进一步了解PCV2引起仔猪免疫抑制的机制及防治PCVD的新策略。
　　选取8头PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）血清抗原、抗体均为阴性的普通断奶仔猪，无菌取其脾脏制成单细胞悬液后，随机分为4组:对照组、NF-κB抑制剂组（抑制剂组）、PCV2组和NF-κB抑制剂-PCV2组（抑制剂-PCV2组），进行体外培养，并于0、6、12、24和48 h收获悬浮的淋巴细胞及细胞培养上清液。间接免疫荧光法(IFA)定位检测PCV2感染淋巴细胞的情况和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)入核情况;流式细胞仪定量检测PCV2感染淋巴细胞比例;利用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-4、IL-10和IL-12的蛋白含量;Western blot定量检测细胞核中NF-κB/p65，细胞浆中髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、磷酸化抑制性κB（phosphorylated IκB，p-IκB）、NF-κB/p65蛋白含量的变化;电泳迁移率法（electrophoretic mobility shifft assay，EMSA）检测细胞核中NF-κB与DNA的结合率。分析IL-4、IL-10和IL-12含量的变化与MyD88-NF-κB信号途径的关系。试验结果显示:IFA定位检测显示PCV2感染6h后可在淋巴细胞内观察到PCV2抗原，并主要存在细胞浆;流式细胞定量检测结果，PCV2对淋巴细胞的感染率随时间而增加，感染后6h为1.19％，到48 h达17.48％。细胞培养上清液中IL-4含量，PCV2组低于对照组及抑制剂-PCV2组，且在12h、24 h、48 h差异显著(P＜0.05)，对照组与抑制剂-PCV2组无差异。感染12 h后PCV2组IL-10含量显著高于对照组(P＜0.05);且抑制剂-PCV2组上清液中IL-10含量与PCV2组并无差异。PCV2组细胞培养上清液中IL-12含量，6h、12h、24 h显著高于同时间对照组(P＜0.05);抑制剂-PCV2组显著或极显著低于PCV2组(P＜0.05或P＜0.01)。PCV2感染后，淋巴细胞胞浆内MyD88的蛋白含量均显著高于同时间对照组（P＜0.01或P＜0.05）;PCV2组与抑制剂-PCV2组之间无显著差异。PCV2组淋巴细胞胞浆内p-Iκ Bα的蛋白含量，24 h时显著高于对照组（P＜0.05），48 h极显著升高（P＜0.01）;抑制剂-PCV2组从6h开始极显著低于PCV2组(P＜0.01)。IFA法定位检测NF-κB/p65入核情况，攻毒后6 h PCV2组淋巴细胞胞核内可观察到NF-κB/p65蛋白核易位并随时间增加。蛋白定量结果表明，PCV2组淋巴细胞胞浆中NF-κB/p65含量逐渐降低，从12h开始均显著低于对照组(P＜0.05);对照组、抑制剂组、抑制剂-PCV2组之间无显著差异。感染后胞核中NF-κB/p65含量逐渐增加，6h到48 h每个时间点均极显著高于对照组(P＜0.01);抑制剂-PCV2组均极显著低于PCV2组（P＜0.01或P＜0.05）。EMSA试验结果表明，感染后12h、48 h，PCV2组淋巴细胞胞核中NF-κB与DNA的结合率极显著高于对照组(P＜0.01)，24 h与对照组相比结合率显著增加（P＜0.05）;抑制剂-PCV2组极显著低于PCV2组（P＜0.01）。结果表明:PCV2可感染体外培养的仔猪淋巴细胞，并通过MyD88-NF-κB信号途径调控淋巴细胞IL-4、IL-12的分泌。

目录

声明

摘要

部分缩写的中英文对照(Abbreviation)

第一篇 文献综述

第一章 PCV2与NF-κB信号通路

1 猪圆环病毒研究进展

2 NF-κB信号转导途径

3 实验目的与意义

第二篇 试验研究

第二章 PCV2通过激活MyD88-NF-κB信号途径调节体外培养仔猪淋巴细胞IL-4和IL-12的分泌

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

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