稻曲病菌T-DNA插入突变体B-726、B-1015侧翼相关基因的克隆

摘要

通过田间致病力试验，从稻曲病菌T-DNA插入突变体库中筛选获得了一株T-DNA插入致病力减弱的突变菌株B-726和一株致病力丧失突变菌株B-1015。本研究分析突变菌株B-726的生物学性状，发现与野生型菌株P1相比，突变菌株B-726在MM，TB3和PSA三种固体培养基上生长速率均下降。在液体培养基PS中，B-726的产生分生孢子的能力显著降低。用PCR检测传代培养5代B-726基因组的T-DNA插入稳定性，结果表明T-DNA能够随着稻曲病菌的传代稳定遗传。Southern杂交分析B-726外源基因插入为单拷贝。利用hiTAIL-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术，克隆与插入位点毗邻的基因全长，结果得到一个全长为1296 bp，该基因由2个长度分别为406bp和798 bp的外显子和1个长度为88 bp的内含子组成。将该基因的cDNA全长序列开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)分析表明，包含1个长度为465 bp的开放阅读框（ORF），可编码154个氨基酸，5'端非编码区（5'-UTR）长度为110 bp，3'端非编码区（3'-UTR）的长度为631bp，将其命名为Uvt-726。序列分析发现，T-DNA插入位点在Uvt-726上游344 bp处。用半定量RT-PCR分析基因表达情况，结果显示Uvt-726基因表达量在B-726中较P1显著下降。在已知的功能蛋白基因中，没有比对到同源基因。克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的新基因，推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。
　　进一步分析稻曲病致病力丧失突变菌株B-1015的生物学性状，发现与野生型菌株P1相比，B-1015的生长速率明显降低，在PS培养基中产孢量也显著降低。将T-DNA两端侧翼序列分别上传到稻曲病菌的全基因组测序数据库中比对，对B-1015的T-DNA插入位点侧翼序列分析，发现T-DNA的插入可能导致了稻曲病菌的基因组发生了重排。RACE PCR分别在两边的侧翼序列上克隆得到一个基因Uvt1015R和Uvt1015L。Uvt1015R基因全长为1560 bp，中间被一个长度为60 bp的内含子隔开，两个外显子的长度分别为631bp和869 bp。ORF分析表明该基因包含一个长度为948bp的开放阅读框可编码295个氨基酸，5'-UTR长度为341 bp，3'-UTR长度为271bp。Uvt1015L基因全长556bp，不合内含子，包含一个长度为351bp的ORF，可编码116个氨基酸，5'-UTR为31 bp，3'-UTR长度为171 bp。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间，RT-PCR结果显示在突变菌株B-1015中Uvt1015R表达量下降，Uvt1015L基因都不表达。在已知的功能蛋白基因中，没有比对到与这两个基因同源基因。稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变，可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt1015R、Uvt1015L基因结构的破坏。
　　分离T-DNA标记的功能基因是研究稻曲病菌致病机制的前提，而解析功能基因在稻曲病菌致病过程中的作用需对基因进行功能验证。将潮霉素磷酸转移酶（HPH）基因作为筛选标记基因，构建UVT-726基因敲除盒。以农杆菌质粒PC-P1tk为载体，利用农杆菌介导转化稻曲病菌将基因敲除盒导入到稻曲病菌。携带基因敲除盒的T-DNA转化到稻曲病菌内，在毒力蛋白的帮助下T-DNA发生异源整合到稻曲病菌基因组，或者发生同源重组，实现目的基因替换。筛选具有潮霉素抗性的转化子，用PCR检测基因敲除的结果，旨在获得UVT-726基因的敲除体，分析该基因在稻曲病菌的致病分子机理上的作用。

目录

声明

摘要

文献综述

第一章 稻曲病研究进展

1．1 稻曲病的症状和危害

1．2 稻曲病发病的影响因素及其防治

1．3 稻曲病菌的分类地位

1．4 稻曲病菌的生物学性状

1．5 稻曲病菌的侵染

1．6 稻曲病菌的分子生物学研究

第二章 农杆菌介导转化在真菌功能基因研究中的进展

1 农杆菌介导真菌遗传转化的原理

2 农杆菌介导真菌转化的载体系统

3 农杆菌介导遗传转化的特点

4 影响农杆菌介导转化效率的因素

5 农杆菌介导遗传转化在真菌功能基因研究中的应用

第三章 本研究选题依据及意义

研究内容

第一章 稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

1．材料和方法

2．结果和分析

3．讨论

第二章 稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

1．材料和方法

2．结果和分析

3．讨论

第三章 农杆菌介导的稻曲病菌功能基因敲除

1．材料和方法

2．结果和分析

3．讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢