叶螨中Wolbachia感染特性及其对宿主生殖、种群遗传和基因表达的影响

摘要

Wolbachia是一类普遍感染多种节肢动物的细胞内共生细菌。前期研究结果表明，Wolbachia宿主类型多样且Wolbachia株系具有较高的遗传多样性。目前已发现A-K11个大组的Wolbachia株系在40％的节肢动物中感染。Wolbachia主要通过细胞质进行垂直传播，与宿主形成稳定的共生关系。然而，相关研究均证明，Wolbachia在不同宿主或同一宿主不同个体间存在水平传播。在自然状态下，Wolbachia的感染动态还受到多种外界条件的影响。Wolbachia能够通过多种方式对宿主进行生殖调控。此外，Wolbachia能够影响宿主的适合度、免疫反应及其他生理功能等。因此，Wolbachia对于推动宿主进化及应用于害虫和人类疾病控制等方面均具有理论与实践意义。
　　叶螨是农业生产上的重要害虫，其个体小、繁殖快、适应性强、易产生抗药性，是公认的最难防治的有害生物之一。Wolbachia在多种叶螨中感染且对宿主生物学造成复杂的影响。利用共生菌开展叶螨防治为我们提供了新的思路。因此，明确Wolbachia在叶螨中的感染特性及其影响将为进一步利用这一共生菌开展防治奠定基础。
　　Wolbachia在叶螨中能够引起复杂的生物学影响，这些影响作用与Wolbachia株系相关。本研究首先应用PCR技术对在我国危害比较严重的截形叶螨Tetranychustruncates、二斑叶螨T.urticae、豆叶螨T.phaselus、红叶螨T.pueraricola、神泽叶螨T.kanzawai和山楂双叶螨Amphitetranychus viennensis体内的Wolbachia感染情况进行检测，并对Wolbachia的wsp基因进行序列分析和基因重组检测。结果表明，叶螨中的Wolbachia株系具有较高的遗传多样性，其中截形叶螨感染两种分化较大的株系。不同叶螨感染特有的Wolbachia株系说明Wolbachia与其宿主存在一定的协同进化关系。二斑叶螨和截形叶螨感染同一株系的Wolbachia，可能由于水平传播造成。同时，不同株系Wolbachia的wsp基因间普遍存在着基因重组现象。
　　由于wsp基因普遍的基因重组现象，基于单基因wsp建立的叶螨中Wolbachia的系统发育分析可能不能准确地揭示Wolbachia的进化历史及种群动态。应用多位点序列分型方法(MLST)研究叶螨属相近叶螨物种中Wolbachia的感染特性，不仅避免了单基因重组的困扰，还可以与其它物种中的研究结果进行比较分析。本研究应用多位点序列分型技术对22个自然种群的5种叶螨（截形叶螨、二斑叶螨、豆叶螨、红叶螨和神泽叶螨）Wolbachia的感染情况进行了分析，并探讨了Wolbachia感染状态与叶螨宿主系统发育关系，线粒体多样性及地理格局的关系。结果表明，Wolbachia感染率在不同叶螨中从31.4％至100％不等，Wolbachia株系也呈现出较高的遗传多样性。因此，Wolbachia侵染叶螨种群缘于多次独立的侵染过程。与其他节肢动物中的研究结果类似，相同种的叶螨可以感染分化较大的Wolbachia株系，不同种叶螨感染相同或相近的Wolbachia株系，说明Wolbachia在叶螨种群中有可能借助植物进行水平传播。叶螨生存环境的生态因子或其他因素导致了Wolbachia在叶螨不同种群间分布格局的不同。
　　山楂双叶螨是一种危害果树的重要害螨。为了明确Wolbachia在山楂双叶螨种群中的感染特性及其对叶螨生殖的影响，本研究采集自然种群的山楂双叶螨，运用多位点序列分型技术对其体内Wolbachia感染情况及株系进行分析;通过杂交试验及生物学观察，揭示Wolbachia对山楂双叶螨生殖的影响。结果表明自然种群山楂双叶螨感染一种株系的Wolbachia(wVie)，该种Wolbachia株系与小黑花椿象Orius strigicollis和丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis中的Wolbachia株系亲缘关系较近，而与叶螨属其他叶螨感染的Wolbachia株系亲缘关系较远。Wolbachia与4种分化较小的宿主线粒体单倍型相关联，说明Wolbachia在山楂双叶螨种群中的侵染历史较短。Wolbachia对山楂双叶螨的产卵力不产生影响。Wolbachia在山楂双叶螨中诱导产生弱的CI作用，表现为不感染雌虫与感染雄虫交配，卵孵化率显著低于其他杂交组合，后代性比及死亡率变化不明显。
　　通过分析Wolbachia传播过程中，感染类型与叶螨宿主线粒体单倍型的关系，明确了Wolbachia对叶螨线粒体多样性及进化的影响，为应用mtDNA开展叶螨种类鉴定及种群遗传分析提供了指导。在研究的7个截形叶螨种群中共检测到5种Wolbachia株系，分别是wtru1、wtru5、wtru7、wtru8和wtru12，表明Wolbachia在截形叶螨种群中存在多次感染。对截形叶螨个体进行线粒体COI基因单倍型分析，共发现10个线粒体单倍型。进一步分析发现，感染个体的单倍型多样性及核苷酸多样性均低于不感染个体。单倍型网络系统发育及分子变异模型(AMOVA)分析结果表明，线粒体单倍型受地理因素影响较小，而与Wolbachia感染类型显著相关。这一研究结果证实了Wolbachia感染能够影响叶螨的种群遗传结构及遗传多样性。
　　通过前期研究，我们已经明确Wolbachia在叶螨中引起复杂的生殖调控及适合度改变。然而，Wolbachia与叶螨相互作用的分子机制还不清楚。为解决这一问题，在本研究中，我们通过高通量测序等手段研究了Wolbachia对二斑叶螨宿主基因表达的影响，以期能初步揭示Wolbachia提高二斑叶螨生殖力及诱导CI的分子机制。我们实验室之前建立了一种稳定感染Wolbachia的二斑叶螨品系，进一步研究发现Wolbachia在宿主中诱导强CI作用，并能提高雌虫的产卵量。在本研究中，我们以这种二斑叶螨品系为实验材料，借助转录组测序等手段，以期揭示二斑叶螨宿主对Wolbachia感染的转录响应情况。通过高通量测序及与参考基因组比对，我们获得用于后续分析的转录组数据。分析结果表明，二斑叶螨的基因表达存在性别特异性。Wolbachia感染影响宿主的基因表达。对差异表达基因分析发现，宿主的多种代谢途径受Wolbachia感染影响，尤其是参与氧化还原过程、消化及解毒过程、脂质运载蛋白以及其他未知功能途径的基因表达受Wolbachia感染影响。此外，我们发现在Wolbachia感染时，几个可能参与叶螨生殖过程的基因表达存在差异。值得注意的是，和其它节肢动物宿主中的研究结果不同，Wolbachia感染并不引起二斑叶螨免疫相关基因表达的显著差异。研究结果有助于我们理解宿主与Wolbachia的相互作用关系。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．共生菌Wolbachia概述

2．Wolbachia的形态特征及在节肢动物中的分布

3．Wolbachia系统发育研究

4．Wolbachia在宿主中的感染特性及传播方式

5．Wolbachia对宿主的生殖调控作用及其机理研究

5．1 Wolbachia诱导宿主细胞质不亲和研究现状

5．2 Wolbachia诱导宿主孤雌生殖研究现状

5．3 Wolbachia诱导宿主雌性化研究现状

5．4 Wolbachia诱导杀雄研究现状

6．Wolbachia对宿主种群遗传的影响

7．Wolbachia对宿主的其他影响

8．应用高通量测序技术研究宿主-Wolbachia互作的分子机理

9．应用Wolbachia控制害虫及人类疾病

10．叶螨中Wolbachia的研究进展

11．本研究目的及意义

第二章 叶螨中Wolbachia株系wsp基因序列多样性与重组分析

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 叶螨总DNA的提取

1．3 wsp基因扩增与测序

1．4 序列分析

1．5 系统发育分析

1．6 重组检测

2 结果与分析

2．1 叶螨种和wsp序列间的关系

2．2 序列分析及系统发育树的建立

2．3 wsp基因重组分析

3 讨论

第三章 Wolbachia在叶螨种群中的感染特性与分布格局分析

1 材料与方法

1．1 叶螨采集与鉴定

1．2 DNA提取，Wolbachia感染检测及多位点序列分型

1．3 序列分析

1．4 系统发育分析

2 结果与分析

2．1 不同叶螨种群中Wolbachia感染情况

2．2 叶螨中Wolbachia株系的MLST鉴定及分析

2．3 Wolbachia感染与宿主线粒体多样性相关性分析

2．4 Wolbachia感染与宿主地理分布的相关性分析

3 讨论

第四章 山楂双叶螨中Wolbachia感染特性及其对宿主生殖的影响

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 Wolbachia检测及多位点序列分型

1．3 山楂双叶螨COI基因扩增及测序

1．4 系统发育分析

1．5 生物学实验供试虫源

1．6 杂交实验

2 结果与分析

2．1 自然种群山楂双叶螨Wolbachia感染情况

2．2 山楂双叶螨感染Wolbachia株系类型及系统发育分析

2．3 山楂双叶螨线粒体COI基因单倍型分析

2．4 Wolbachia对山楂双叶螨生殖的影响

3 讨论

第五章 Wolbachia对截形叶螨种群遗传的影响

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 Wolbachia基因、mtDNA-COI序列扩增及测序

1．3 mtDNA序列及系统发育分析

1．4 种群遗传分化分析

2 结果与分析

2．1 截形叶螨mtDNA-COI序列分析

2．2 截形叶螨Wolbachia感染情况分析

2．3 截形叶螨mtDNA-COI单倍型分析

2．4 截形叶螨种群遗传分化分析

3 讨论

第六章 Wolbachia对二斑叶螨基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 叶螨饲养与样本收集

1．2 RNA提取及质量检测

1．3 测序文库构建及测序

1．4 生物信息学分析

1．5 应用qRT-PCR方法验证RNA-Seq结果

2 结果与分析

2．1 二斑叶螨RNA质量检测结果

2．2 测序数据结果统计

2．3 测序数据整体质量评估

2．5 基因表达水平分析

2．6 Wolbachia感染对二斑叶螨基因表达的影响

2．7 差异表达基因的GO富集分析

2．8 差异表达基因的KEGG富集分析

2．9 Wolbachia感染引起差异表达的其他候选基因

2．10 qRT-PCR验证结果

3 讨论

参考文献

附录

在读期间论文发表及奖励情况

致谢