仔猪肠致病性大肠杆菌的分离、鉴定及其菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

摘要

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起新生仔猪腹泻的主要病原。本研究从江苏和江西两省部分地区的规模化猪场发生腹泻的新生仔猪中分离得到携带菌毛基因的大肠杆菌并对菌毛基因型的分布特征进行了分析。利用基因工程技术在大肠杆菌中分别表达了F4、F5、F6菌毛亚单位基因faeG、fanC、fasA并验证了重组菌毛蛋白的免疫原性。以纯化的重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法，并初步应用于临床检测。本文研究内容如下:
　　1仔猪肠致病性大肠杆菌的分离和鉴定
　　2012年10月至2013年9月间，从江苏、江西2省部分地区的13家猪场采集临床疑似新生仔猪腹泻粪样146份，从中分离、鉴定出116株大肠杆菌。根据GenBank发表的大肠杆菌F4、F5、F6菌毛的基因序列分别设计特异性引物，对116株致仔猪腹泻大肠杆菌的菌毛基因进行PCR检测。结果有20株(17％)大肠杆菌检测出F4菌毛基因，6株(5.2％)检测出F5菌毛基因，19株(16％)检测出F6菌毛基因，有5株(4.3％)大肠杆菌同时检测出2种菌毛基因。通过溶血性试验发现，有13株(10％)大肠杆菌完全溶血，6株(5.2％)不完全溶血。通过分析菌毛类型与溶血性之间的相关性作为评判大肠杆菌致病性的重要指标。
　　2产肠毒素大肠杆菌F4、F5和F6菌毛亚单位基因的克隆表达
　　为了实现产肠毒素大肠杆菌F4、F5和F6菌毛亚单位基因的体外表达，为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供材料基础，本研究将去除信号肽序列的faeG、fanC、fasA基因序列克隆至原核表达载体pET-28a中，构建重组表达质粒pET-28a-faeG、pET-28a-fanC、pET-28a-fasA并经PCR及双酶切鉴定构建正确后分别转化至E.coliBL21中。经IPTG诱导表达的F4、F5、F6菌毛亚单位蛋白相对分子质量分别为27kDa、20kDa、22kDa，表达产物主要以包涵体形式存在。经Ni-Agarose His纯化和复性后进行Western-blot分析，确定所得蛋白抗原性良好。
　　3产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立及作用为建立检测产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体的方法，本研究以纯化的重组F4菌毛蛋白免疫新西兰长耳兔制备免疫血清，并以重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法并对该方法的反应条件进行了优化。确定ELISA最佳条件为:包被抗原浓度为35 ng/mL;50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭2 h;血清最佳稀释度为1∶3200;血清最佳作用时间为1 h;酶标二抗的最佳作用时间为1h。经试验验证，该方法具有特异性好、重复性好、稳定性强等特点。利用建立的间接ELISA方法与PCR方法进行符合性试验得出总符合率为96.2％。临床检测312份未经ETEC免疫的猪血清，阳性检出率为9.9％。该方法可以用于ETEC F4菌毛抗体的临床检测。

目录

声明

摘要

第一章 仔猪黄白痢的研究进展

1 仔猪黄白痢的病原学

2 仔猪黄白痢的发病特征

3 仔猪黄白痢的流行情况

参考文献

第二章 产肠毒素大肠杆菌菌毛的研究进展

1 菌毛的主要类型

1．1 F4菌毛

1．2 F5菌毛

1．3 F6菌毛

2 菌毛的生化特性

3 菌毛的表达条件

4 菌毛的流行病学分布

参考文献

第三章 仔猪黄白痢的防治

1 加强饲养管理

2 微生态制剂治疗

3 抗生素治疗

4 疫苗预防

4．1 全菌灭活疫苗

4．2 亚单位疫苗

4．3 基因工程疫苗

4．4 ETEC疫苗的展望

参考文献

第四章 仔猪肠致病性大肠杆菌的分离和鉴定

1 材料与方法

1．1 病料样本采集

1．2 培养基

1．3 其他试剂

1．4 参考菌株

1．5 PCR引物

1．6 细菌的分离与纯培养

1．7 革兰氏染色镜检

1．8 生化试验

1．9 PCR模板的制备

1．10 PCR检测菌毛基因

2 结果

2．1 细菌分离和生化鉴定

2．2 分离菌株的菌毛基因检测

2．3 分离菌株的溶血性与菌毛类型的相关性

3 讨论

参考文献

第五章 产肠毒素大肠杆菌F4、F5和F6菌毛亚单位基因的克隆表达

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒载体

1．2 主要试剂

1．3 目的基因的扩增

1．4 PCR产物的克隆与转化

1．5 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

1．6 重组蛋白表达形式的鉴定

1．7 重组蛋白的纯化与复性

1．8 纯化产物的Western-blot分析

2 结果

2．1 fAeG、fanC及fasA的PCR扩增

2．2 重组原核表达质粒的构建

2．3 faeG、fanC、fasA基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达

2．4 重组蛋白的纯化与复性

2．5 重组蛋白表达Western-blot鉴定

3 讨论

参考文献

第六章 产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立及作用

1 材料与方法

1．1 血清及生化试剂

1．2 免疫血清的制备

1．3 间接ELISA方法条件的优化

1．4 间接ELISA方法I临界值的确定

1．5 阻断试验

1．6 特异性试验

1．7 重复性试验

1．8 符合性试验

1．9 临床样品检测

2 结果

2．1 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定

2．2 血清最佳作用时间的确定

2．3 封闭液的确定

2．4 酶标二抗工作浓度和时间的确定

2．5 间接ELISA方法临界值的确定

2．6 阻断试验

2．7 特异性试验

2．8 重复性试验

2．9 符合性试验

2．10 临床猪血清检测

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文