乙草胺微生物降解途径中关键酶基因克隆与酶学特性研究

摘要

氯代乙酰胺类除草剂因分子结构中具有酰胺基团(CONH-)而得名，因其高效、高选择性而在全球范围内广泛使用。乙草胺[2'-乙基-6'-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代-N-乙酰苯胺]是氯代乙酰胺类除草剂的重要代表，主要用于一年生禾本科杂草和部分阔叶杂草的防除。乙草胺的主要生物降解产物为2-氯-N-(2'-甲基-6'-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)和2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)，研究表明残留在环境中的乙草胺及其降解中间产物对环境和农业生态系统都具有一定的危害。
　　本实验室以乙草胺为靶标，筛选到一株能将乙草胺转化为CMEPA的菌株Rhodococcus sp.T3-1和一株能将CMEPA水解为MEA的菌株Delftia sp.T3-6。本文以Rhodococcus sp.T3-1为材料，对乙草胺N-脱乙氧甲基酶（简称N-脱烷基酶）基因进行克隆，以Delftia sp.T3-6为材料，对CMEPA水解酶基因进行克隆，并对重组酶的酶学性质进行了研究。
　　快速有效的酶活测定方法是蛋白质纯化的前提，本论文首先建立了一种快速测定CMEPA水解产物MEA的方法。在20 mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中，10-50μM的2，6-甲乙基苯胺在铁氰化钾催化下与4-氨基安替比林反应生成紫红色物质，该物质在535 nm的吸光值与MEA浓度有良好的线性关系，底物CMEPA、SDS、甲醇等有机试剂、1mM的金属离子对显色反应无显著影响。温度和pH对显色反应影响显著。该方法也适用于其它苯胺苯酚类衍生物的测定。
　　通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Butyl-650M疏水层析和Superdex G-200凝胶层析4步纯化流程，获得达电泳纯的目的蛋白(DamH)。纯化倍数为17.7倍，蛋白回收率为0.29％。肽指纹分析得到两条肽段APEADDELRR和TNPLANPLKASYQGFPR，N端测序15个氨基酸序列为Gly-Thr-Ser-Pro-Gln-Ser-Asp-Phe-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Gln-Ser.
　　根据N端氨基酸序列及肽指纹图谱设计引物，利用染色体步移技术克隆到Delftiasp.T3-6 CMEPA水解酶编码基因damH，该基因全长903 bp，编码300个氨基酸，分子量为32 kDa，与来源于Acinetobacter sp.SE19的环已醇降解基因簇的ChnC一致性为67％。构建表达菌株E.coli BL21(DE3)-(pET-29a(+)-damH)，经诱导培养后，实现重组酶DamH在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。DamH是一个具有酯类水解活性的酰胺水解酶，在以CMEPA为底物时比活力为5036 U/mg，在以4-硝基苯酯为底物时比活力为612 U/mg。DamH最适底物为CMEPA，其Km和kcat值分别为0.197 mM和2804.32 s-1。DamH具有催化芳基酰胺类化合物水解和对硝基苯酯类、三酰甘油酯和ε-已内酯水解的能力，最适酶反应pH为6.5，最适酶反应温度为35℃。Mn2+离子对酶活有促进作用，Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+对酶活有抑制作用;PMSF、SDS强烈抑制酶的活性，而EDTA和DMSO对酶活影响较小。
　　定点突变实验结果显示DamH活性中心可能由S149-E244-H274三联体结构组成，除活性中心构成外，三维结构模拟结果也显示DamH与酯酶3FAK类似，具有一个典型的Gly-X-Ser-X-Gly保守序列和S149，E244，H274三联体催化中心以及HGX结构(79HGG81)。DamH在蛋白浓度为15 mg/mL，结晶池母液为:0.2M乙酸铵，pH7.1，21％ PEG3350，坐滴气相扩散法20℃下约18天能长出衍射能力达3.4(A)的晶体。
　　乙草胺的降解首先要进行N-脱乙氧甲基，生成CMEPA进而被DamH水解为MEA。该过程由乙草胺N-脱烷基酶催化完成，乙草胺N-脱烷基酶性质非常不稳定，普通的超声波破碎法会导致酶快速失活。本论文首先研究了细胞破碎提取乙草胺N-脱烷基酶粗酶液的方法和测活体系，建立了以液氮研磨方法制备Rhodococcus sp.T3-1粗酶液的方法，在含1 mM NADH+H+，40％蔗糖，0.1 M NaCl，10 mM MgCl2，2 mMβ-巯基乙醇的20 mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中，利用粗酶液和DamH两步催化形成MEA，利用显色法可间接检测到乙草胺N-脱烷基酶活性。
　　通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析从Rhodococcus sp.T3-1粗酶液中分离到三个蛋白，肽指纹图谱结果显示三个蛋白分别为铁氧化还原酶EthA(45 kDa)、铁氧还蛋白EthD(11 kDa)和细胞色素P450单加氧酶EthB(43 kDa)。基于氨基酸序列分析和核酸序列分析，设计引物扩增ethABCD基因簇，分别构建不同基因组织形式的表达菌株，以诱导表达菌株全细胞进行催化实验证实了参与乙草胺N-脱乙氧甲基反应的三个蛋白为EthA-EthD-EthB。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 氯代乙酰胺类除草剂

1．1 氯代乙酰胺类除草剂的作用机理

1．2 氯代乙酰胺类除草剂对环境和农业生产的影响

1．3 氯代乙酰胺类除草剂在环境中的降解过程

2 乙草胺生物降解代谢途径中的关键酶

2．1 催化N-脱烷基起始反应的氧化酶

2．2 CMEPA水解酶研究进展

3 氯代乙酰胺除草剂降解基因在转基因作物中的应用

4 当前研究存在的问题及立题依据

参考文献

第二章 Delftia sp．T3-6菌株CMEPA水解酶的纯化

第一节 CMEPA水解产物定量测定方法研究

1 材料与方法

2 结果与分析

第二节 Delftia sp．T3-6菌株粗酶液特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

第三节 Delftia sp．T3-6菌株CMEPA水解酶的纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

本章讨论

本章小结

参考文献

第三章 Delftia sp．T3-6菌株CMEPA水解酶基因克隆与重组酶酶学特性研究

第一节 Delftia sp．T3-6 CMEPA水解酶基因克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

第二节 重组酶DamH酶学特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

第三节 重组酶DamH定点突变与结晶条件研究

1 材料和方法

2 结果与分析

本章讨论

本章小结

参考文献

第四章 Rhodococcus sp．T3-1菌株N-脱烷基酶复合体纯化与基因克隆

第一节 Rhodococcus sp．T3-1乙草胺N-脱烷基酶纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

第二节 Rhodococcus sp．T3-1 N-脱烷基酶基因克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

本章讨论

本章小结

参考文献

全文总结

主要创新点

下一步工作设想

附录

攻读博士学位期间发表的论文目录

致谢