萝卜胚发生相关基因鉴定及新型SSR标记开发

摘要

萝卜（Raphanus sativus L.）是原产于我国的重要蔬菜作物，为十字花科萝卜属一、二年生草本植物。萝卜不仅营养丰富，而且具有较高的药用食疗价值。萝卜为典型的异花授粉作物，杂种优势十分明显，但常规育种所需年限长，且多代自交易出现性状退化等不良现象。单倍体具有单套染色体组，经染色体加倍成双单倍体后应用于优势育种，可以显著加快品种选育进程。游离小孢子培养是植物单倍体育种的重要手段，但该技术在萝卜育种中存在胚状体诱导率低、成胚基因型范围狭窄、体胚发生关键基因尚需分离鉴定等问题仍限制了该技术在萝卜品种改良中实际应用;此外，萝卜中基于编码序列的SSR标记开发数量还十分有限，难以为高密度遗传图谱及重要性状定位分析提供高效的遗传标记。鉴于此，由于萝卜小孢子体胚发生过程较难控制，基于合子胚与体细胞胚发生机制相似性，本研究选用授粉后不同时期合子胚作为研究萝卜胚发生相关基因研究的试验材料，在转录组水平分离鉴定萝卜胚发生过程中重要差异表达功能基因与起关键调控作用的miRNAs;并基于NCBI数据库中EST序列及萝卜转录组序列开发新型SSR标记。取得主要研究结果如下:
　　1)由于合子胚与体细胞胚发生过程较为相似，为解析萝卜胚发生分子遗传学特征，进一步提高萝卜胚发生能力，本研究采用高通量测序技术对萝卜高代自交系‘NAU-DY13’授粉前(0 DAP)、授粉后(7_ DAP、15_ DAP)的合子胚进行数字表达谱分析。RNA-Seq技术分别获得7，191，808(97.31％)、7，235，080(98.25％)和6，963，130(97.1％)干净序列，对其进行参考基因组序列比对、基因覆盖率分析后，筛选到的的差异基因分别为分别为3，314(7_DAPvs0_DAP)个、4，268(15_DAPvs0_DAP)个及1，213（15_DAPvs7_DAP）个，其中，三文库间一致上调基因54个，下调基因16个。GO分析表明，不同阶段差异表达基因参与了细胞发育、单一器官发育、代谢过程及对刺激物的响应等过程，并具有较好的结合能力、催化活性、转运活性、核酸结合的转录因子活性等功能，主要参与主要包括淀粉与蔗糖代谢过程(ko00500)、植物激素信号转导途径(ko04075)、各种氨基酸(ko00400，ko00260，ko00250)、有机物(ko00908，ko00790，ko00940)的合成代谢等127个pathway代谢途径，其中，以参与到植物激素信号转导的差异基因数量最多，且部分差异表达基因如SERK、LRR、LEA、CDC及AUX1等在萝卜胚发生过程中发挥重要作用。研究结果为分离鉴定萝卜胚发生关键基因提供理论依据。
　　2)以萝卜高代自交系‘NAU-DY13’为材料，基于转录组序列与同源克隆技术成功分离萝卜Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase(SERK)、Agamous like15(AGL15)、Cell Division Control2(CDC2)和Late Embryogenesis Abundant(LEA3)基因序列。研究分别获得RsSERK1、RsAGL15、RsCDC2和RsLEA3基因的基因组DNA及cDNA序列，其开放阅读框（ORF）分别为1905bp、818bp、882bp和285bp，编码635、279、293和94个氨基酸。采用生物信息学方法，综合多种在线软件对萝卜RsSERK1和RsAGL15蛋白的基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、卷曲螺旋及二、三级结构进行了分析预测;采用Genome walking的方法，分离克隆到Baby Boom（RsBBM）和RsCDC2基因5’上游区启动子序列，包含启动子特定结构元件（如TATA-box，CAAT-box），还有一些激素响应元件和种子特异调控元件等，主要参与萝卜生长发育过程。利用qRT-PCR技术分析了萝卜胚发生发育过程中RsSERK1、RsAGL15、RsBBM、RsCDC2和RsLEA3基因的表达特征，且RsSERK1基因主要表达于花期的花器官中，具有一定的组织表达特异性。
　　3)分别构建了萝卜高代自交系‘NAU-DY13’受精前(0 DAP)和受精后(4-15 DAP)胚珠2个小RNA文库，利用新一代测序(NGS)技术，分离到144个保守和34个非保守的miRNA（属于43个已知的miRNA家族）和38个新型miRNA（属于28个miRNA家族）。通过比较分析两个miRNA库，共29个已知的和10个新型的miRNA家族在萝卜胚胎发育过程中差异表达。利用qRT-PCR技术分析验证了miRNA表达模式，发现某些miRNA具有组织特异性，并在不同发育时期特异表达。此外，靶基因预测结果显示，大部分靶基因为参与调节植物生长、发育和代谢的转录因子。值得注意的是，某些靶基因，如生长素响应因子和agamous-like MADS-box蛋白参与了萝卜胚胎的发育。研究结果为在分子水平阐明miRNA在植物胚胎发育调节中的作用机制提供了理论基础。
　　4)基于NCBI数据库的289，621条萝卜EST序列，共选取51，625条EST序列进行SSR位点的搜寻，并鉴定到2，917个SSR位点。这些位点中包含二、三、四、五及六核苷酸重复序列类型，其各核苷酸重复类型的数量分别为945(32.40％)、1，300(44.57％)、179(6.14％)、262(8.98％)和231(7.92％)。其中，AG/CT(16.15％)和GA/TC(13.58％)为最丰富基元类型。共设计并合成1，082对萝卜EST-SSR引物，其中，864(79.85％)对引物能够得到有效扩增。通过对48个萝卜种质进行遗传多样性分析可知，这些标记的多态性信息含量(PIC)值0.33到0.84不等，平均值为0.58。此外，随机选取53个标记对近缘种进行PCR扩增，发现其中有25个标记能够得到有效的扩增产物。研究结果表明，这些新型的EST-SSR标记具有较高的多态性、可重复性，并且在近缘物种中具有较好的通用性，这为萝卜研究工作中的分子标记辅助选择及遗传图谱的构建提供一种及有力的研究工具。
　　5)利用萝卜肉质根转录组文库，从73，084条unigene和150，455条contig序列中，共成功检索到位于11，311条unigene序列上的11，928个SSR位点。三核苷酸重复序列式最常见的重复类型，占总数的52％。同时，共开发genic-SSR标记5，503个，从中选取1，052对引物进行合成及验证，78.23％的引物对能够产生稳定条带。选取67个标记分析32个萝卜品种的遗传多样性，其引物表现出的多态性信息含量值介于0.49-0.89之间。本研究采用MCID（Manual cultivar identification diagram）策略，仅用6个genic-SSR标记即可快速有效对32个基因型进行鉴定。此外，对新开发的标记进行了近缘种间通用性分析。利用所开发的标记对游离小孢子培养再生植株进行分子鉴定，发现在共显性标记中，纯合的再生植株在一个等位位点上均为单一条带，并且来源于同一小孢予的再生植株间无差异条带。结果表明，作为遗传连锁及基因标签分析的基础，新型genic-SSR标记将加速萝卜遗传育种相关研究。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 高等植物合子胚与体细胞胚发生

1．1 合子胚发育的过程

1．2 胚胎发育的转录组学研究

1．3 高等植物体细胞胚发生

1．4 高等植物合子胚与体细胞胚发生比较

2 SSR标记开发与应用

2．1 SSR位点的搜索及标记的开发

2．2 新型SSRs的分布特征

2．3 新型SSR标记的应用

3 本研究目的和意义

第二章 萝卜合子胚发生相关基因表达谱分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 测序结果统计与分析

2．2 胚发生过程中差异基因的筛选

2．3 差异基因表达模式分析

2．4 GO功能注释分析

2．5 KEGG显著性富集分析

2．6 qRT-PCR验证

3 讨论

3．1 RNA-Seq技术为差异基因的分离提供有效手段

3．2 萝卜胚发生相关系列关键基因得到成功分离与鉴定

第三章 萝卜胚发生相关基因克隆与表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 扩增与克隆结果

2．2 基因DNA和cDNA序列克隆及分析

2．3 基因的蛋白特征分析

2．4 氨基酸序列同源性及系统树分析

2．5 萝卜RSBBM、RsCDC2基因启动子序列克隆与分析

2．6 基因表达特性分析

3 讨论

3．1 SERK基因是胚发生过程中重要的功能基因

3．2 AGL15基因在胚成熟过程中的关键调控作用

3．3 BBM基因能够促进植物的胚发生过程

3．4 CDC2和LEA3基因有效调控植物胚发生过程

第四章 萝卜胚发生过程相关microRNA分离与鉴定

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 萝卜合子胚小RNA文库分析

2．2 萝卜胚发生过程中已知miRNA的鉴定

2．3 萝卜胚发生过程中新型miRNA的鉴定

2．4 萝卜胚发生相关miRNA的鉴定

2．5 miRNA靶基因的预测与功能注释

2．6 qRT-PCR miRNA及其靶基因验证

3 讨论

3．1 萝卜胚发生相关miRNA的特性分析

3．2 miRNA表达模式分析

3．3 靶基因的功能预测

第五章 基于NCBI数据库萝卜EST-SSR标记开发与应用

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 基因组DNA提取

1．3 萝卜非冗余EST序列的获得

1．4 EST-SSR标记的开发

1．5 引物源序列的功能注释分析

1．6 EST-SSR标记的应用

2 结果与分析

2．1 萝卜EST序列的获得

2．2 萝卜EST序列中SSR的鉴定与分析

2．3 萝卜EST序列GO功能注释

2．4 EST-SSR引物的设计与验证

2．5 利用萝卜EST-SSR标记进行遗传多样性分析

2．6 ESR-SSR标记在十字花科物种中通用性研究

3 讨论

3．1 萝卜ESR-SSR位点的鉴定与特征分析

3．2 萝卜EST-SSR标记的开发与应用

3．3 萝卜EST-SSR标记通用性研究

第六章 基于萝卜转录组序列开发新型genic-SSR标记

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 小孢子时期观察

1．3 小孢子的分离及培养

1．4 基因组DNA提取

1．5 新型genic-SSR标记的开发

1．6 序列GO功能注释

1．7 新型genic-SSR标记的应用

1．8 小孢子再生植株纯系鉴定

2 结果与分析

2．1 萝卜转录组序列中SSR的特征分析

2．2 序列GO功能注释

2．3 genic-SSR标记的开发与验证

2．4 萝卜基因型的遗传多样性分析

2．5 MCID的构建

2．6 genic-SSR标记的通用性研究

2．7 分子标记对小孢子再生植株的鉴定分析

3 讨论

3．1 NGS的快速发展推动了SSR标记的开发

3．2 萝卜转录组中SSR特性分析

3．3 genic-SSR标记的成功开发

3．4 genic-SSR标记较好地应用于品种的分析鉴定

3．5 genic-SSR标记具有较高多态性

3．6 genic-SSR标记十字花科近缘种中通用性较高

3．7 基于编码序列的SSR标记能够鉴定纯合株系

全文结论

创新之处

参考文献

附录

博士在读期间发表学术论文

致谢