解淀粉芽孢杆菌SQR9吲哚乙酸合成途径及促生效应的研究

摘要

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueficiens)SQR9是本实验室从黄瓜根际分离的一株促生菌株，对黄瓜专化型病原菌尖孢镰刀菌有很强的拮抗功能。在盆栽和大田试验中，该菌株表现出良好的促生和土传病害防控效果，其与腐熟堆肥制成的微生物有机肥在农业生产中已得到广泛应用。
　　本文通过盆栽实验验证了解淀粉芽孢杆菌SQR9对植株生长的促进作用，检测了SQR9产生的各种促生因子，通过转录水平分析、基因敲除、基因融合表达和随机突变建库的方法探索了SQR9吲哚乙酸(IAA)合成的机制，并研究了IAA对SQR9促生能力的影响，获得了以下研究结果:
　　1.在黄瓜及玉米盆钵实验中，解淀粉芽孢杆菌SQR9能显著促进两种植物的生长。1×109 CFU SQR9活体菌处理(T2)比5×108 CFU活体菌的处理(T1)促生效果更好，而两个灭活菌体的处理无显著差异。与对照相比，T1和T2处理的地上部分干重、黄瓜株高、根长和根表面比例分别升高60.1％、45.7％、29.3％和30.7％以及90.0％、71.6％、56.3％和65.6％。在玉米处理中，T1处理的玉米株高、地上部分干重、根长和根表面积升高比例分别为36.2％、30.6％、32.1％和20.0％以及T2处理相对应的指标升高65.3％、47.8％、42.6％和52.0％。
　　2.以哥伦比亚型拟南芥为材料与SQR9和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α共培养16d后，对其长势进行观察。与PBS对照和E.coli DH5α处理相比，SQR9处理的拟南芥生长旺盛，根长和叶片大小均高于前两者，以此可以初步推断，SQR9可以产生挥发性物质(VOC)促进拟南芥的生长。
　　3.通过化学分析的方法表明，SQR9在实验室条件下可产生植酸酶、2，3-丁二醇、乙偶姻、IAA和赤霉素(GA3)，且在培养基中加入色氨酸后IAA产量明显升高。
　　4.根据植物和微生物中已报道的IAA合成途径，通过预测SQR9基因组(NCBI登录号: CP006890)中基因的蛋白功能域，筛选出SQR9中14个可能与IAA合成相关的候选基因。为检测筛选出的基因是否参加色氨酸依赖型IAA合成途径，我们对加入色氨酸培养的细胞中这些基因表达情况进行转录水平分析。结果发现6个基因转录水平明显上调，包括:patB，编码一个可能的转氨酶，上调3.5倍;yhcX,预测的腈水解酶，上调3倍;dhaS，编码一个可能的吲哚乙醛脱氢酶，上调了2.5倍;ysnE，预测为IAA乙酰转移酶基因，上调了2倍;yclB，预测蛋白为芳香酸脱羧酶，上调了1.5倍;yclC基因和yclB基因位于同一个基因簇，编码芳香酸脱羧酶，上调了2倍。我们推测这六个基因可能参与SQR9中IAA合成的IPyA途径、TAM途径、IAN途径和一个未确认的合成途径。
　　5.采用双交换重组的方法对筛选出的六个基因进行敲除。发现突变菌株△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX IAA产量分别为野生型SQR9菌株的14％、23％、45％和76％，而突变体△patB和△yclB IAA产量和SQR9相比没有明显变化。采用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pUBC-19对突变体△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX进行互补实验，结果表明各突变体的互补菌株IAA合成恢复到和SQR9相当的水平。由结果可知，ysnE编码的色氨酸酰基转移酶可能参与SQR9中IAA合成的主要途径，IPyA和TAM途径也颇为重要，而IAN途径对SQR9中IAA的合成贡献较小。
　　6.根据上述反转录定量PCR及突变子分析的结果，我们挑选出三个可能组成IPyA途径的基因(patB、yclC和dhaS)并通过同源和异源表达加以验证。通过融合PCR将这三个基因连接起来，再插入到构建好的pUBC19-P43质粒中，使其在P43启动子的调控下表达。为测定同源与异源表达菌株产IAA的能力，使用舍空载pUBC19-P43质粒的枯草芽孢杆菌168和SQR9作为对照。SQR9过表达菌株(SQR9-E)IAA的产量是SQR9-CK的4倍，约为42 mg l-1，枯草芽孢杆菌过表达菌株(168-E)与对照相比IAA产量升高10倍，约为22 mg l-1。
　　7.利用mariner转座元件Himar1转座诱变体系构建解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株的突变体文库。在3000个转化子中筛选得到三株IAA产量稳定变化的突变株，在SQR9-IAA1突变株的发酵液中检测到IAA含量很低，SQR9-IAA2突变株发酵液中的IAA为野生型SQR9的50％，而SQR9-IAA3突变株的IAA产量明显升高，约为野生型SQR9的2.4倍。通过转座子插入位点分析可知，在SQR9-IAA1菌株中，转座子插入位点为qox基因簇的qoxB基因;在SQR9-IAA2菌株中，转座子插入到ylmD基因;突变体SQR9-IAA3插入位点为yngF。这三个基因在SQR9中参与IAA合成的机理还需要进一步的研究。
　　8.为研究IAA产量变化对SQR9促生效果的影响，我们采用IAA合成变化的突变菌株研究其对黄瓜和玉米生长及对黄瓜根系发育的影响。野生型SQR9在菌液浓度为107 CFU ml-1时，对黄瓜根的伸长具有最显著的促进效果，菌液浓度在l08 CFUml-1时，对黄瓜初生根的伸长具有抑制效果，却刺激次生根的形成。在菌液浓度为107CFU ml-1时，与对照相比，SQR9处理的根长增长了137％，根表面积增长了88％。IAA产量下降的菌株△ysnE对黄瓜的根长和根表面积均没有显著促进效果。IAA产量升高的过表达菌株SQR9-E处理过的黄瓜与对照相比根长增长了58％,但与SQR9处理相比降低了32％，与对照相比根表面积增长了166％，与SQR9处理的黄瓜相比根表面积仅下降了15％。盆栽实验中，与对照相比，各处理均表现出对黄瓜和玉米生长的促进作用。突变菌株SQR9-IAA1对黄瓜和玉米的促生能力与野生型SQR9相比略有降低，其中黄瓜植株的生物量和株高降低了约24％和19％，玉米植株的生物量和株高降低了约21％和17％。与SQR9处理相比，△ysnE处理黄瓜两个指标分别下降了23％和15％，玉米的两个指标分别下降15％和16％。IAA产量下降50％的菌株SQR9-IAA2促生能力与野生型菌株相似。IAA产量升高的菌株SQR9-IAA3和SQR9-E对黄瓜和玉米的生长促进效果比野生型SQR9菌株更为明显，在黄瓜中SQR9-IAA3处理的植株的生物量和株高升高了约40％和19％，SQR9-E处理的两个指标分别升高41％和18％;在玉米中SQR9-IAA3处理的植株的生物量和株高升高了约21％和29％，SQR9-E处理的两个指标分别升高18％和31％。

目录

声明

摘要

缩略语及专有词汇检索表

第一章 文献综述

1 植物根际促生菌研究进展

1．1 植物营养与土壤微生物

1．2 植物根际促生菌

1．3 根际促生菌促生机制

2 细菌中IAA的生物合成途径

2．1 微生物合成IAA

2．2 细菌IAA生物合成途径

2．3 IAA结合和储藏

3 基于基因组的IAA生物合成关键基因的筛选

4 细菌IAA生物合成的影响因素

4．1 IAA生物合成的环境调节因子

4．2 IAA生物合成的遗传调节因子

5 革兰氏阳性菌的IAA合成

6 本研究的目的、意义和技术路线

6．1 本研究的目的和意义

6．2 研究的技术路线图

参考文献

第二章 解淀粉芽孢杆菌SQR 9促生效果的研究

1 材料方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 解淀粉芽孢杆菌对黄瓜和玉米株高的影响

2．2 解淀粉芽孢杆菌SQR9对黄瓜和玉米根系的影响

2．3 解淀粉芽孢杆菌SQR9对黄瓜和玉米生物量的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 解淀粉芽孢杆菌SQR9主要促生机理的研究

1 材料方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 解淀粉芽孢杆菌SQR9基因组促生相关基因

2．2 解淀粉芽孢杆菌SQR9产生的挥发性气体物质对拟南芥生长的影响

2．3 解淀粉芽孢杆菌SQR9产半挥发性气体

2．4 解淀粉芽孢杆菌SQR9产植酸酶能力

2．5 解淀粉芽孢杆菌SQR9产植物激素IAA检测

2．6 定量分析SQR9 IAA和GA3产量曲线

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 解淀粉芽孢杆菌SQR9 IAA合成途径的研究

1 材料方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 通过基因组分析的IAA合成相关基因

2．2 转录结果分析

2．3 相关基因的敲除

2．4 基因敲除的突变子pXKZ的消除

2．5 野生型SQR9与突变子的生长曲线测定

2．6 突变子及相应的互补菌株与野生型SQR9产IAA的差异

2．7 表达载体的构建及转化

2．8 表达菌株蛋白差异分析

2．9 同源和异源表达菌株LAA产量升高

3 讨论

4 小结

参考文献

第五章 采用转座子TnYLB-1构建解淀粉芽孢杆菌SQR9的突变体文库筛选IAA产量变化的突变株

1 材料方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 pMarA质粒转入SQR9kz

2．2 转化子中质粒pXKZ的消除

2．3 IAA合成变化突变菌株初筛以及初筛菌株抗性验证

2．4 IAA合成变化的突变子复筛

2．5 IAA合成变化的突变子株转座子插入位点分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第六章 IAA合成变化对SQR9菌株促生作用的影响

1 材料方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 测定项目

2 结果与分析

2．1 不同浓度的IAA标准品对黄瓜根际发育的影响

2．2 不同浓度的sQR9对黄瓜根际发育的影响

2．3 IAA产量变化的菌株对黄瓜根际发育的影响

2．4 IAA产量变化的菌株对黄瓜的促生效果

2．5 IAA产量变化的菌株对玉米的促生效果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论及展望

创新点

附录

博士期间发表及待发表论文

致谢