组织工程皮肤试剂盒的研发及在治疗犬小孢子菌感染中的应用

摘要

基于已有研究，发现皮肤真菌患病犬样本中94.29％的犬为单一真菌种类病原体。考虑到犬小孢子菌的高感染率及存在动物到人的传染风险，本研究选取犬小孢子菌感染犬作为研究对象。
　　从新兽药的临床前研究减少动物的使用量和从众多可供使用的药物中筛选疗效更好的药物这2个因素出发，本研究采用个体犬分离的真菌感染特制的组织工程皮肤试剂盒，以检测待使用的外用抗真菌药物，探索在治疗犬小孢子菌感染中的应用。其中，为了对试剂盒的结构特别是角质层结构的稳定性的反复测试及探索一套组织工程皮肤试剂盒的运输培养基，本研究还对组织工程皮肤的表皮层结构和运输培养基进行了标准化。
　　1.组织工程皮肤的构建及试剂盒组装
　　利用培养的犬皮肤成纤维细胞和角质形成细胞能够成功构建出组织工程皮肤。经切片和HE染色检测显示，成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物经过处理并未残存活细胞成分，角质形成细胞紧密贴附于成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物表面，并增殖分化为多层细胞成分，具有与犬天然皮肤类似的表皮层微结构，包括角质层、颗粒层和基底层。
　　2.组织工程皮肤试剂盒表皮层结构的标准化
　　为了对组织工程皮肤的表皮层标准化，通过定量的方式计算表皮层屏障功能总积分，试验组为8分，对照组为6分。组织工程皮肤的等级评定为:试验组“优秀”，对照组“良好”，显然试验组在屏障功能上优于对照组。
　　3.组织工程皮肤试剂盒运输培养基的标准化
　　为了对组织工程皮肤试剂盒的运输条件特别是运输时营养供给标准化，通过定量的方法计算出运输后的组织工程皮肤屏障功能总积分7分，等级评定为“优秀”，与对照组无显著差异。
　　4.试剂盒在治疗犬小孢子菌感染中的应用
　　从犬患处分离真菌，经过纯化培养和鉴定培养筛选出犬小孢子菌，并将菌接种于预先制备好的组织工程皮肤检测试剂盒孵育6h，之后对试验组和对照组进行组织学染色和流式细胞仪计数分析，结果显示药物作用试验组，盐酸特比奈芬、硝酸咪康唑和环毗酮胺组抗感染药物阻断效率AIDE平均值分别为:87.45％、72.50％和69.14％。样本犬用药前临床症状积分为2，动物治疗试验显示，盐酸特比奈芬组在3w时临床症状积分为0，临床症状积分下降指数SSRI已达100％并持续至4w;硝酸咪康唑和环吡酮胺组4w时临床症状积分为1和0，对应的SSRI分别为50％、100％。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

前言

第一章 组织工程技术在体外替代检测中的应用

1 皮肤腐蚀检测

1．1 定义

1．2 检测方法

1．3 研究现状

1．4 新方法验证进展

2 皮肤刺激检测

2．1 定义

2．2 检测方法

2．3 研究现状

2．4 新方法验证进展

3 光毒性检测

3．1 定义

3．2 检测方法

3．3 研究现状

3．4 新方法验证进展

4 眼刺激性检测

4．1 定义

4．2 检测方法

4．3 研究现状

4．4 新方法验证进展

5 遗传毒性检测

5．1 定义

5．2 检测方法

5．3 研究现状

5．4 新方法验证进展

第二章 犬小孢子菌的研究进展

1 流行病学

1．1 人体感染

1．2 动物感染

2 形态学

3 基因分型

3．1 PCR-RFLP方法

3．2 RAPD方法

4 临床学

4．1 人体临床

4．2 动物临床

5 致病机理

6 抗真菌研究

6．1 患者相关

6．2 动物相关

第三章 组织工程皮肤的构建及试剂盒组装

1 材料与方法

1．1 试剂

1．2 犬皮肤细胞的培养

2 结果

2．1 皮肤细胞的培养

2．2 组织工程皮肤

3 讨论

第四章 组织工程皮肤试剂盒表皮层结构的标准化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 培养液的配制

1．3 组织工程皮肤的构建

1．4 表皮层屏障功能的检测

2 结果

3 讨论

第五章 组织工程皮肤试剂盒运输培养基的标准化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 运输培养基

1．3 运输条件

1．4 HE染色

1．5 屏障功能检测

2 结果

3 讨论

第六章 试剂盒在治疗犬小孢子菌感染中的应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 培养基配制

1．3 真菌病初步诊断

1．4 犬小孢子菌的培养、纯化、鉴定

1．5 犬小孢子菌感染试剂盒

1．6 检测结果的判定

1．7 临床试验

2 结果

2．1 犬小孢子菌的培养、纯化、鉴定

2．2 试剂盒检测结果

2．3 临床试验结果

3 讨论

参考文献

全文总结

本文创新点

攻读博士期间的主要成果

致谢