扬子鳄TLR2、TLR7基因克隆及TLR7蛋白表达、多抗制备和组织表达分析

摘要

由于栖息地的破坏和环境因素等影响，扬子鳄种群数量曾一度急速下降，如今在安徽宣城、浙江长兴等地成立了自然保护区后，已经通过人工规模化圈养的方式来实施大面积保护。经过多年的努力，我国人工饲养的扬子鳄种群数量迅速扩大，已发展到现在的上万余条，养殖经验和养殖技术也在逐渐完善。扬子鳄虽为我国一级珍稀保护动物，然而到目前为止，相对于国外鳄鱼的多种细菌和病毒病的报道，我国关于扬子鳄疾病研究及感染机制的报道仍然为数不多。因此，开展对扬子鳄疾病免疫相关蛋白（如Toll样受体）的研究将有助于对其固有免疫作用及机制的深入了解，进而减少疾病发生，促进扬子鳄的健康养殖。与此同时，运用分子生物学和免疫学知识和专业技术来分析、预防疾病，制定科学的规模化管理方针，也是我国加强扬子鳄保护的关键之处。
　　本文通过比较不同物种的TLR2和TLR7保守区基因序列，分别设计一对简并引物，采用RT-PCR技术，从南京汤山养殖场扬子鳄肝脏cDNA中扩增目的片段，并与其它不同物种相应的核苷酸和预测的氨基酸序列进行同源性分析，构建系统发育进化树。扩增结果显示，TLR2和TLR7片段大小分别约为526 bp和433bp，测序表明，扩增得到的序列与最新发布的浙江长兴扬子鳄TLR2、TLR7序列相似度均达到99％。同源性分析显示，扬子鳄与密西西比鳄、龟鳖类和禽类的同源性较高;进化树分析显示，扬子鳄和密西西比鳄同在一个分支上，二者的亲缘关系较近。
　　将扬子鳄TLR7基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组表达载体pET-32a(+)-TLR7，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，在37℃条件下，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳，分析该蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达，采用切胶纯化的方式切下重组蛋白，免疫新西兰白兔制备多抗。SDS-PAGE检测结果表明重组菌在约35ku处有特异性蛋白条带，间接ELISA法检测多抗的效价，结果显示重组蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶25600，Western-blot鉴定表明pET-32a(+)-TLR7重组蛋白得到了正确表达并能与特异性的抗体反应，具有良好的免疫原性。
　　提取冬眠期和非冬眠期采集的肝、脾、肺、肾、小肠5种组织的总蛋白，经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，将制备的兔多克隆抗体作为一抗，β-actin为内参，Western-blot检测分析各组织TLR7蛋白含量相对表达差异情况，同时提取肝、脾、肺、肾、小肠、肌肉的总RNA，实时荧光定量PCR测定TLR7 mRNA的表达差异。结果显示TLR7的表达存在组织特异性，mRNA和蛋白的表达不完全一致，且冬眠期的表达量普遍低于非冬眠期。

目录

声明

摘要

第一章 扬子鳄研究进展

1 扬子鳄简介与起源

2 扬子鳄分布与保护

3 扬子鳄的经济价值

4 扬子鳄的研究现状

5 扬子鳄的疾病发生

参考文献

第二章 爬行动物免疫学研究进展

1 爬行动物的免疫器官

2 爬行动物的天然免疫

3 爬行动物的获得性免疫

4 研究爬行动物免疫的意义

参考文献

第三章 Toll样受体研究进展

1 Toll样受体概述

2 Toll样受体2研究进展

2．1 分布与结构

2．2 生物学功能

2．3 与疾病关系

3 Toll样受体7研究进展

3．1 分布与结构

3．2 生物学功能

3．3 与疾病关系

参考文献

第四章 扬子鳄TLR2、TLR7基因克隆及其序列分析

1 实验材料

1．1 动物组织

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 总RNA提取与反转录

2．2 引物的设计与合成

2．3 PCR反应体系和反应条件

2．4 PCR产物回收与纯化

2．5 PCR产物的连接

2．6 感受态的制备

2．7 转化

2．8 菌落的PCR鉴定

2．9 测序分析

3 结果

3．1 TLR2、TLR7扩增结果

3．2 质粒的鉴定与测序

3．3 同源性分析与进化树构建

4 讨论

参考文献

第五章 TLR7重组蛋白的原核表达及多抗制备

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 菌种和质粒

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 重组质粒的构建

2．3 重组蛋白的原核表达

2．4 重组蛋白的切胶纯化

2．5 多克隆抗体的制备

2．6 多抗效价的测定

2．7 Western-blot鉴定

3 结果

3．1 酶切鉴定结果

3．2 重组蛋白的诱导表达与纯化

3．3 兔多抗血清的效价测定

3．4 Western-blot验证结果

4 讨论

参考文献

第六章 TLR7蛋白及mRNA组织表达差异分析

1 实验材料

1．1 动物组织

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 Western-blot测定TLR7蛋白的表达

2．2 荧光定量PCR测定TLR7 mRNA的表达

3 结果

3．1 Western-blot检测结果

3．2 荧光定量PCR结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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