非生物胁迫下暖季型草坪草内参基因筛选及铁离子调控耐盐性的机制研究

摘要

内参基因是维持生物体生命活动的细胞器骨架的重要组成部分和参与生命代谢活动的基本单元，不受时空影响而在细胞内稳定表达。选取适宜的内参基因对基于实时荧光定量PCR技术进行精确的基因表达分析具有重要意义。本研究第一部分以典型暖季型草坪草狗牙根（Cynodon dactylon）为材料，在盐、干旱、高温和低温四种非生物胁迫下，应用实时荧光定量PCR技术，分析了ACT、 EF1α、 TUB、PP2A、TIP41、CACS、UPL7和GAPDH8个候选内参基因在不同组织和不同非生物胁迫下的表达情况，并利用Genorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四种程序，计算分析基因表达稳定性。结果表明:在盐、干旱、冷和高温四种非生物胁迫下，8个内参基因在狗牙根叶片和根系中的表达稳定性存在差异，其中，PP2A和CACS在盐胁迫下根和叶片中、干旱胁迫下叶片中、冷或热胁迫下根中表达稳定性较高，EF1α和TIP41在干旱胁迫下根系中能较稳定表达，UPL7、TUB和GAPDH在冷胁迫下叶片中稳定表达，PP2A和TIP41在热胁迫下叶片中稳定表达。
　　海滨雀稗(Paspalum vaginatum)是多年生暖季型盐生草坪植物，实验室前期通过酵母筛选从海滨雀稗耐盐品种‘Sea Isle2000’全长cDNA表达文库中捕获得一个耐盐候选基因——铁离子转运体，由此推测海滨雀稗优异的耐盐性归因于在高盐环境中具有超强的离子转运能力，维持植物体内的离子平衡。而铁是植物生长发育的必需元素之一，参与叶绿素合成、光合呼吸代谢途径，海滨雀稗的耐盐性可能与铁吸收相关。基于此，开展了以下试验:
　　1、以海滨雀稗(Paspalum vaginatum)耐盐品种‘Sea Isle2000’为材料，通过基因克隆得到耐盐候选基因——铁离子转运体PvIRT(cDNA全长1107bp、编码369aa)，异源转化盐敏感的酵母细胞，显著提高了其耐盐性。通过qRT-PCR及锚定PCR等方法，进一步明确了PvIRT基因在盐胁迫下的表达模式（盐处理抑制根系PvIRT表达）及克隆了PvIRT基因的上游1134bp的启动子序列，结果显示PvIRT基因受盐胁迫显著下调表达,PLACE数据库分析PvIRT启动子序列发现启动子包含了许多胁迫相关的顺式元件，如MYB-site，bHLH-site，ABA诱导，盐胁迫诱导，JA或病原体诱导元件;此外，瞬时表达实验表明PvIRT蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞膜上。这为进一步研究该基因分子调控机制提供了线索。
　　2、以海滨雀稗(Paspalum vaginatum)耐盐品种‘Sea Isle2000’为试验材料，采用水培法研究了盐胁迫和正常生长条件下，比较了正常铁浓度(20μ mol/L)和高浓度铁(80μ mol/L)处理后对海滨雀稗生物量、叶片含水量、光合特性、根系活力和地上部和根系中Na+、K+和Fe2+等离子含量的影响。结果发现，正常生长条件下，高浓度铁处理对海滨雀稗地上部和根系生物量，叶片的叶绿素含量、光合速率、光化学效率、相对含水量、蒸腾速率、气孔导度无显著差异，而明显提高根系离子含量(K+，Mg2+,Mn2+，Fe2+，Cu2+)和叶片离子含量(Mn2+，Cu2+)。盐胁迫下，高浓度铁(80μmol/L)处理表现出较高的根系活力和地上部生物量，同时显著提高海滨雀稗的Fe2+、Mg2+和Cu2+等元素的含量，提高叶片的叶绿素含量、光化学效率和光合能力，促进植株生长发育;且植株根系通过增加对K+的吸收和Na+外排，维持细胞离子稳态，减少钠离子毒害，提高了海滨雀稗的耐盐性。
　　3、以海滨雀稗(Paspalum vaginatum)耐盐品种‘Sea Isle2000’的根系为试验材料，采用水培法研究了正常生长下和盐胁迫（10天）下，高浓度铁(80μmol/L)处理对海滨雀稗根系Na+/H+转运体(PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4)、Na+/K转运体(PvCBL4)以及H+-质子泵(PvP-H+-ATPase, PvV-H+-ATPase)等基因表达的影响。结果发现，正常生长条件下，高浓度铁处理显著降低了PvCBL4和PvCBL4基因表达，而位于液泡膜的V-H+-ATPase基因表达量大幅度增加;盐胁迫下，高浓度铁(80μmol/L)诱导了 PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4和PvCBL4、PvV-H+-ATPase等基因表达。因此，盐胁迫下，高浓度铁通过提高液泡膜上的PvV-H+-ATPase基因表达，为液泡膜Na+/H+逆向转运体提供质子驱动力，将过量的钠离子液泡区域化，同时上调质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白表达，将Na+排到胞外，减少了钠离子在植物体内过量积累，维持植物体内离子稳态，从而缓解盐害。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 实时荧光定量PCR技术与内参基因的筛选

1．1 实时荧光定量PCR技术概述

1．2 内参基因概述

1．3 内参基因稳定性分析

1．4 本研究目的与意义

2 植物耐盐研究进展以及铁离子的耐盐机制

2．1 盐胁迫对植物的影响

2．2 植物对盐胁迫的反应机制

2．3 盐胁迫下SOS基因家族调控机理及其研究进展

2．4 盐胁迫下HKT基因的调控机理及其研究进展

2．5 H+-ATPase在植物耐盐中的作用及其研究进展

2．6 铁离子参与植物盐胁迫的机制

2．7 研究目的与意义

第二章 四种非生物胁迫下狗牙根内参基因的筛选和验证

1 试验材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 狗牙根总RNA的提取与检测

2．2 内参基因的RT-PCR扩增

2．3 扩增特异性和扩增效率分析

2．4 内参基因的Cq值及CV值分析

2．5 内参基因表达的稳定性分析

3 讨论

第三章 海滨雀稗PvIRT基因及其启动子克隆与表达分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 载体、试剂及试剂盒

1．3 引物合成、测序及生物信息软件

1．4 海滨雀稗cDNA全长文库的酵母表达与耐盐筛选

1．5 海滨雀稗PvIRT基因的克隆

1．6 原生质体表达载体的构建

1．7 海滨雀稗PvIRT基因亚细胞定位和表达分析

1．8 海滨雀稗PvIRT启动子的克隆

2 结果与分析

2．1 耐盐候选基因的获得及初步验证

2．2 海滨雀稗候选耐盐基因PvIRT全长及序列分析

2．3 PvIRT亚细胞定位检测

2．4 盐胁迫下PvIRT基因的表达特性分析

2．5 PvIRT启动子的克隆及序列分析

3 讨论

第四章 铁离子参与海滨雀稗耐盐性的研究

第一节 高浓度铁处理提高海滨雀稗耐盐性的生理机制

1 试验材料与方法

2 试验结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 铁离子提高海滨雀稗耐盐性的分子机制

1 试验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文

致谢