大豆疫霉G蛋白α亚基互作蛋白PsPP2C的功能分析

摘要

大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根腐病是世界大豆生产上的主要病害之一，每年给全世界的大豆生产造成重大的经济损失。因此，如何防控大豆根腐病成为了研究者关心的热点。大豆根腐病的初侵染源是大豆疫霉的卵孢子，卵孢子在土壤或病残体中可以存活多年，在合适的条件下再次萌发引起病害的发生。大豆根腐病在田间大范围流行的主要原因是大豆疫霉在合适的温度和湿度条件下进行无性繁殖，产生孢子囊，释放大量的游动孢子。在田间传播过程中，游动孢子识别寄主分泌的化学信号，定向游动定殖到大豆根部完成对寄主植物的侵染。因此，对大豆疫霉游动孢子阶段和卵孢子阶段的分子调控机制的了解有利于我们进一步防控病害的发生。
　　大豆疫霉G蛋白α亚基互作蛋白的筛选。G蛋白信号途径在大豆疫霉侵染寄主过程中起十分重要的作用。研究发现PsGPA1（编码大豆疫霉G蛋白α亚基）对游动孢子的游动性、对异黄酮的趋化性以及致病力有重要贡献。在此基础上进一步筛选PsGPA1的互作蛋白并研究其功能，对揭示大豆疫霉中G蛋白信号途径的传递方向打下基础。本文通过GST Pull-down的方法筛选大豆疫霉PsGPA1互作蛋白，共获得了75个PsGPA1的候选互作蛋白。通过肽段数的匹配数及对候选互作蛋白的功能预测，我们最终挑取了4个蛋白进行深入的研究。
　　4个候选蛋白与Gα亚基一对一互作验证。我们选取了Ps144365(命名为PsGBP)、Ps136278(PsIlvC)、Ps127024(PsPLD)、Ps144252(PsPP2C)这4个蛋白与PsGPA1通过原核诱导表达在体外进行GST Pull-down一对一互作验证。结果表明，PsIlvC和PsPP2C分别与PsGPA1互作。在G蛋白信号途径中，Gα亚基存在激活与失活两种不同状态，当Gα亚基与GTP结合时，Gα亚基处于激活状态;当Gα亚基与GDP结合时，Gα亚基处于失活状态。当Gα亚基外源添加GTP孵育时，PsPP2C与Gα亚基互作;当Gα亚基外源添加GDP孵育时，PsPP2C与Gα亚基互作。换而言之，PsPP2C与激活态的PsGPA1和失活的PsGPA1都互作。
　　PsPP2C磷酸酶活性的测定。PsPP2C编码的蛋白预测是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，可以催化蛋白的去磷酸化作用。我们通过原钼酸盐:孔雀石绿:磷酸盐形成三聚体显色的方法测定反应体系中磷酸基团的含量，从而检验出了PsPP2C磷酸酶活性。此外，我们发现PsGPA1与PsPP2C的互作对PsPP2C磷酸酶活性的改变没有帮助。PsPP2C参与大豆疫霉的生长发育、有性生殖、无性繁殖及致病过程。为了进一步了解PsGPA1互作蛋白PsPP2C的生物学功能，我们利用PEG介导的大豆疫霉遗传转化技术得到三个PsPP2C沉默转化子和三个过表达转化子。表型分析表明PsPP2C沉默转化子的生长速率下降，致病能力减弱，卵孢子产量下降，孢子囊产生延后且数量减少;PsPP2C定位于细胞膜结构上;PsPP2C的过量表达不引起大豆疫霉生长速率，致病能力，孢子囊的产生等表型的变化。通过对转化子表型的观察我们推测PsPP2C广泛参与调控大豆疫霉细胞生长、有性生殖、无性繁殖及致病等过程，对细胞生命活动起着至关重要的作用。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 蛋白磷酸酶的在真核生物中研究进展

1 蛋白磷酸酶概述

2 蛋白磷酸酶的生物学功能

参考文献

下篇 研究内容

第一章 Gα互作蛋白的筛选及PsPP2C磷酸酶活性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 PsPP2C参与调控大豆疫霉的生长发育及致病性

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢