粘细菌来源的麦芽六糖淀粉酶AmyM高效表达及新糖化型淀粉酶AmyC的酶学性质研究

摘要

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是一类能水解淀粉分子内α-1，4和α-1，6糖苷键的水解酶类的总称，其生成的产物一般都是具有α-异头碳构型的糖类物质。α-淀粉酶广泛分布于植物（大麦、土豆、水稻和玉米等），动物（唾液和胰腺等）及微生物（细菌、真菌及放线菌）中，α-淀粉酶制剂已在酒精、淀粉糖、酿酒和变性淀粉等行业得到普遍应用，在工业生产中具有相当重要的地位。
　　本文对粘细菌来源的α-淀粉酶基因amyM进行了高效表达和酶学性质研究。在原核表达系统大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和真核表达系统毕赤酵母Pichiapastoris GS115中对α-淀粉酶基因amyM均实现了异源表达，并对重组表达菌株Pichia pastoris GS115(pEFαA-amyM)进行了培养条件和培养基的优化，初步确定了摇瓶发酵培养的条件，采用了更加经济易得的糖蜜和葡萄糖作为发酵碳源。在50L发酵罐中实现了重组酶的高密度发酵，产酶量在诱导60 h后能达到223 mg/L的酶量，基本满足大规模生产的需求。重组酶的酶学性质稳定，在以可溶性淀粉作为底物反应时主要生成的水解产物为麦芽六糖，占到总产物的54％以上;在高浓度的盐溶液或乙醇环境中，该酶具有较高稳定性，因此该重组酶AmyM具有良好的工业应用前景。
　　粘细菌来源的另一个α-淀粉酶基因amyC在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功实现异源表达，经过Ni-NTA亲和层析柱纯化后，对该酶酶学性质进行了研究。通过以可溶性淀粉为底物的蓝值快速下降现象和产物的旋光度测定确定其为内切型的α-淀粉酶。以麦芽寡糖和可溶性淀粉等多糖类物质为底物时，通过水解产物分析发现该酶作用的主要产物为葡萄糖到麦芽四糖的混合物，该酶能作用的最小糖底物为麦芽三糖，属于糖化型α-淀粉酶。底物谱实验表明该酶能在水解α-1，4糖苷键的同时也能水解α-1，6糖苷键，对麦芽三糖的水解产物时间曲线显示有四糖物质的生成，分析其有转糖苷的活性。重组酶AmyC的最适反应温度为50℃，最适pH值为6.0，该酶在pH4.0-7.0之间能维持较高稳定性，β-巯基乙醇和二硫苏糖醇均能促进该酶活性，其活性不依赖于Ca+，通过以上酶学性质研究定义该酶为一个多功能的新糖化型α-淀粉酶。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 淀粉酶的研究进展

1．1 淀粉

1．2 淀粉酶的分类

1．3 α-淀粉酶

2 毕赤酵母表达系统研究进展

2．1 毕赤酵母表达系统

2．2 毕赤酵母菌株

2．3 毕赤酵母表达载体

2．4 毕赤酵母的高密度发酵

第二章 α-淀粉酶AmyM在毕赤酵母中的表达和酶学性质研究

第一节 表达菌株的构建

1 材料与方法

2 实验方法

3 结果与分析

第二节 重组酶AmyM的酶学性质研究

1 材料与方法

2 结果与分析

第三节 表达菌株的发酵条件优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 本章小结和讨论

第三章 α-淀粉酶AmyC的克隆、表达和酶学性质研究

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 培养基、试剂和仪器

1．3 目的基因amyC的扩增、纯化和TA克隆

1．4 表达载体pET29a-amyC的构建

1．5 重组表达载体pET29a-amyC的诱导表达

1．6 重组酶AmyC的酶学性质研究

2 结果与分析

2．1 重组酶AmyC的SDS-PAGE

2．2 温度和pH对重组酶AmyC的活性和稳定性影响

2．3 金属离子对重组酶AmyC的活性影响

2．4 有机试剂、螯合剂等对重组酶AmyC的活性影响

2．5 重组酶AmyC的底物特异性

2．6 重组酶AmyC对不同底物的水解产物分析

2．7 重组酶AmyC对麦芽三糖的作用时间图

2．8 重组酶AmyC作用可溶性淀粉的蓝值测定

2．9 重组酶AmyC作用于可溶性淀粉的旋光度变化

3 本章讨论及小结

参考文献

全文总结

主要创新点

附录

攻读硕士学位期间发表的论文目录

致谢