重要叶螨线粒体基因组与转录组的测序与进化分析

摘要

叶螨科(Tetranychidae)属于节肢动物门(Arthropoda)、螯肢动物亚门(Chelicerata)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)、真螨总目(Acariformes)、恙螨目(Trombidiformes)、前气门亚目(Prostigmata)、游殖螨股(Eleutherengona)、缝颚螨亚股(Raphignathae)、叶螨总科(Tetranychoidea)，其中物种有很多是农业生产中的重要害螨。叶螨外观十分相似，用于识别的种间形态特征非常少，仅有的几个形态特征在不同的玻片之间也存在种内差异，导致叶螨的识别非常困难。在实验中经常需要结合分子鉴定的方法来识别不同种类的叶螨，但是可供参考的序列十分稀少，而且一些不准确的序列会对分子鉴定产生很大的误导。二斑叶螨是一种世界范围分布的多食性农业害螨，国际上对其研究得很广。我国对二班叶螨也有一定的研究，但是我国的农业害螨种类多，针对于我国的害螨研究还远远不够，可用于害螨的分子标记与参考序列比较少。我国的二斑叶螨不仅有世界范围广泛分布的绿色型，还有我国本地的二斑叶螨红色型，两个色型在形态上十分相似，但是二者的交配会产生部分的不亲和现象，红色型的分类地位存在争议。山楂叶螨以前被划分为叶螨属（Tetranychus），后经研究发现其分子标记基因序列的遗传距离大于叶螨属内物种的遗传距离，遂把它独立划分出一个新属——双叶螨属Amphitetranychus），但是其划分的依据存在一定的不足，现在仍有人把它划分到叶螨属内，在分类学上存在一定的争议。
　　针对以上问题，笔者首先通过长PCR的方法扩增了二斑叶螨红色型(Tetranychusurticae red morph)、二斑叶螨绿色型(T.urticae green morph)、神泽叶螨（T.kanzawai）、卢氏叶螨(T.ludeni)、马来叶螨（T.malaysiensis）、豆叶螨（T.phaselus）、红叶螨(T.pueraricola)、截形叶螨（T.truncatus）和山楂叶螨(Amphitetranychus viennensis）的全线粒体基因组，利用高通量测序技术对全线粒体基因组进行测序，对线粒体基因组进行注释之后，比较了叶螨之间线粒体基因组的差异，分析了线粒体基因组的碱基组成、遗传距离、进化模式以及碱基替换的饱和性，并构建了叶螨科全线粒体基因组的进化树。进一步根据所有能够获得的螯肢亚门的全线粒体基因组的氨基酸序列确立了系统发育关系，确立了叶螨以及螯肢亚门其他物种的进化地位。对我国常见叶螨神泽叶螨、卢氏叶螨、马来叶螨、豆叶螨、红叶螨和截形叶螨进行了转录组测序，对原始序列进行过滤后拼接并注释，筛选出同源基因构建进化树，计算同源基因的dN/dS值，对转录组的微卫星(EST-SSR)进行查找。获得主要结论如下:
　　1)叶螨的线粒体基因组大小大致在13000 bp左右，相比于一般的后生动物要短许多，这可能由于叶螨拥有十分短小的A+T富集区，大量截短的tRNA以及更加紧密的线粒体基因组所导致的。注释之后发现叶螨科内物种的线粒体基因顺序并未发生重排，但是叶螨的基因顺序相比于古老的模式物种发生了大量的重排事件。其中20个基因(7个蛋白编码基因、11个tRNA和2个rRNA)在线粒体基因组的正链上，其余的基因(6个蛋白编码基因和11个tRNA)在负链上。不同叶螨的相对同义密码子使用模式、氨基酸使用偏好、密码子的核酸组成上大体一致。但是叶螨属和双叶螨属在AT与GC偏倚上与全爪螨属正好相反。
　　2)叶螨线粒体基因组存在大量截短的tRNA，并且不能折叠成经典的三叶草结构，丢失部分发夹结构。tRNA的二级结构在叶螨不同种之间比较保守，只有少数tRNA的二级结构在种间产生变化。所有叶螨线粒体基因trnⅠ的反义密码子下游有三个不成对的碱基，导致反义环拥有8个碱基，这种异常tRNA的产生时间应该在叶螨科从其他螨类分化之后，叶螨科物种分化之前产生的。
　　3)对叶螨科线粒体基因组进行了碱基组成同质化分析。但是相当多的两两序列对否定了同质化假设，说明叶螨科线粒体基因组存在异质性，而且全爪螨属与其他物种的异质性差异指数非常高，这可能与其GC与AT偏倚相对于叶螨属和双叶螨属正好相反有关。
　　4)在遗传距离的分析上发现二斑叶螨的红色型和绿色型遗传距离非常短，小于叶螨属内物种间的遗传差异，说明其差异仍属于种内差异。双叶螨属与叶螨属的差异大于叶螨属内差异，这为双叶螨属的单独划分提供了一个有力的支持。
　　5)对碱基替换饱和性分析表明碱基的颠换比转换提供了更多的序列差异，叶螨线粒体基因组的碱基替换并未达到饱和，这说明叶螨线粒体基因组是良好的遗传进化分析的材料。对叶螨科系统发生重建之后发现全爪螨属首先从其他叶螨分离出来，之后是双叶螨属。叶螨属的物种形成一个单系群，与其他属形成姊妹群。
　　6)根据13个蛋白编码基因的串联氨基酸序列进行进化树的构建，以螯肢亚门古老的物种肢口纲（鲎）为外群。利用最大似然法与贝叶斯推论法构建的进化树在拓扑结构上十分相似，并且分支置信值都非常高。螯肢亚门的物种组成一个大单系群，基本上不同分类类群各自组成一个小单系群，但是尾鞭目与鞭蛛目并没有形成独立的单系群，而是聚在一起形成了姊妹群，这可能是由于两个目的关系比较近，或者由于两个目的线粒体基因组序列太少，不足以重建其进化关系而造成的。海蜘蛛纲虽然是螯肢亚门一个独立的纲，但是在进化树上海蜘蛛的物种并没有从蛛形纲中独立出来，并且分化的较晚，这可能暗示蛛形纲的各个物种很可能在很早就与海蜘蛛的祖先分开进化。叶螨科的物种形成一个独立的单系群，枝长非常的长，说明叶螨科的线粒体基因组进化速率较快，叶螨科物种出现的时间较晚。
　　7)分别利用螯肢亚门线粒体基因组13个蛋白编码基因的核酸序列、第一与第二密码子序列、氨基酸序列以及rrnL和rrnS基因的序列构建进化树，并与13个蛋白编码基因的串联氨基酸序列所构建的进化树进行比较。发现单独利用一个基因构建的进化关系并不能反映螯肢亚门的系统发育关系，这可能是单独的基因所包含的进化信号太片面所导致的，所以在构建如螯肢亚门这样的高级分类阶元的进化关系时，所选用的数据集一定要能充分代表各个分类阶元，单个的基因不能够用来重建高级阶元的进化关系。
　　8)神泽叶螨、马来叶螨、卢氏叶螨、豆叶螨、红叶螨和截形叶螨的转录组在不同基因类别上的数量大致相等。对6个叶螨的同源基因查找之后，利用同源基因构建了一个贝叶斯推论树，其拓扑结构与利用线粒体基因组构建的进化树是一致的。利用进化树的进化关系计算同源基因的dN/dS值发现大多数基因的dN/dS值都小于1，经过了纯化选择，神泽叶螨与红叶螨有一部分基因的dN/dS值大于1，其他的叶螨较少有dN/dS值大于1的基因。对6个转录组中的微卫星(SSR)进行查找，虽然不同的叶螨其EST-SSR的组成不尽相同，但是A/T、AG/CT、AAC/GTT和ATC/ATG是最为广泛的存在形式。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．线粒体与线粒体基因组

1．1．真核生物的线粒体

1．2．三羧酸循环与ATP的合成

1．3．线粒体的遗传体系

1．4．线粒体基因组

1．5．线粒体DNA与DNA条形码

2．分子进化与系统发育

2．1．核酸序列的演化

2．2．系统发育的推断

2．3．分子钟假说

3．昆虫基因组研究进展

3．1．基因组研究概述

3．2．基因组的进化

3．3．昆虫基因组研究觋献

第2章 重要害螨的线粒体基因组测序

1．材料与方法

1．1．物种的鉴定

1．2．DNA的提取

1．3．ITS2的PCR扩增

1．4．PCR-RFLP酶切鉴定

1．5．cox1基因的扩增

1．6．PCR产物回收

1．7．连接与转化反应

1．8．质粒提取

1．9．测序

1．10．长片段PCR扩增全线粒体基因组

1．11．长片段测序

1．12．序列分析

2．结果与分析

2．1．测序数据质控

2．2．叶螨线粒体基因组注释与比较

3．讨论

第3章 叶螨科线粒体基因组进化模式的分析

1．材料与方法

1．1．序列来源

1．2．分析方法

2．结果与分析

2．1．线粒体基因组碱基组成的分析

2．2．线粒体基因组遗传距离的分析

2．3．线粒体基因组进化模式的分析

2．4．线粒体基因组碱基替换的饱和性分析

2．5．叶螨科系统发生的重建

3．讨论

第4章 螯肢亚门线粒体基因组系统发育的研究

1．材料与方法

1．1．序列来源

1．2．系统发生

2．结果与分析

2．1．螯肢亚门(Chelicerata)线粒体基因组的系统发育分析

2．2．不同数据集构建的进化树

3．讨论

第5章 叶螨转录组的比较与进化分析

1．材料与方法

1．1．转录组测序

1．2．测序数据质量剪切及统计

1．3．转录组从头组装

1．4．ORF预测

1．5．功能注释

1．6．直系同源基因分析

1．7．微卫星的查找

2．结果与分析

2．1．原始数据质控与拼接

2．2．注释

2．3．直系同源基因分析

2．4．微卫星的查找

3．讨论

全文总结

参考文献

附录

学术论文发表情况

致谢