菜豆根瘤菌中cin群体感应系统对共生固氮和胞外多糖生成影响的研究

摘要

许多细菌能够产生随细菌群体密度变化而改变的信号分子——自体诱导物，当其浓度达到阈值后可以诱导下游基因的表达，这一过程就是群体感应。在根瘤菌中，群体感应调控许多生理功能，其中包括共生固氮和胞外多糖的生成。有文献报道豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中的群体感应系统影响胞外多糖的生成，并且在共生固氮的过程中也发挥了作用。在本文所研究的菜豆根瘤菌(Rhizobium etli CFN42)中，cinR/I位于群体感应调控网络的核心地位。
　　本文以R.etli CFN42为研究对象，首先研究cin系统在R.etli CFN42的共生固氮过程中发挥的作用。对野生型(wildtype，WT)和⊿cinR在蛭石、根瘤菌浓度很低的草坪土和含有大量土著根瘤菌的三叶草土中的定殖能力进行研究，结果表明cinR的缺失并不会对菜豆根瘤菌在土壤中的定殖造成影响。然后研究了WT和⊿cinR在不同土壤条件下在菜豆上的共生固氮情况。在灭菌的蛭石中，cinR的缺失会导致根瘤数量减少以及根瘤中的固氮酶活性降低，说明cin系统参与了R.etli与宿主植物菜豆之间的共生过程。在根瘤菌浓度很低的草坪土中，当接种浓度为104 CFU/g soil时，WT和⊿cinR形成的根瘤数没有差别;而在低接种浓度102 CFU/g soil时，⊿cinR形成的根瘤数量明显少于WT所形成的，在非灭菌土中两者形成的根瘤数量多于在灭菌土中形成的，可能是由于土壤中的土著微生物能够协助R.etli的共生结瘤。在含有根瘤菌的种植三叶草的土壤中，WT和⊿cinR在结瘤数量方面与在草坪土中相似。竞争结瘤能力上，在低接种浓度下，⊿cinR的占瘤率明显低于WT的，表明⊿cinR在结瘤竞争性方面存在明显缺陷;而在高接种浓度下，WT和⊿cinR的占瘤率均有所上升，说明一定阈值的菌体浓度对于R.etli的结瘤竞争性也是至关重要的。
　　本论文接着研究了R.etli中的cin系统对胞外多糖生成的影响。在YEM培养基中分别对WT、⊿cinR和⊿cinI进行培养时，发现⊿cinR/I所形成的菌落要小于WT的。随后通过乙醇沉淀法初步提取菜豆根瘤菌产生的胞外多糖，接着利用蒽酮-硫酸法对胞外多糖进行定量，结果显示WT和⊿cinR所产生的胞外多糖在量上并没有显著性差异。在M1固体培养基中生长，当培养到第4天时，⊿cinR和⊿cinI的菌落轮廓比WT亮，由于像平面上的水滴，在本文中将其命名为“水滴状”菌落;但到第8天时，这种表型便消失了。以上现象说明cin系统可能对胞外多糖的生成量无显著影响，而是影响胞外多糖的组成结构。为了筛选调控“水滴状”菌落表型并受到cin系统调控的下游基因，分别用WT和⊿cinR与SM10λpir(pSC123)进行接合构建突变子文库。通过WT和⊿cinR菌落形态的转变(WT的菌落形态突变成类似于⊿cinR的“水滴状”菌落;⊿cinR的菌落形态回复成与WT相似)来获得候选突变株。在以WT为出发菌株的条件下，得到了转座子多次插入失活的基因——cinR、hipB、COG5001，其中cinR的插入突变表明筛选结果可信，因此对其它2个基因进行研究。构建翻译融合质粒hipB∷lacZ、COG5001∷lacZ，然后分别将重组质粒导入WT和⊿cinR中，检验hipB和COG5001在两者中的表达水平，发现hipB的表达受到CinR的抑制，而COG5001的表达不受CinR调控。同时还发现hipB插入失活菌株出现了生物膜增多的现象，推测hipB与R.leguminosarum bv.Viciae中的raR发挥了相似作用，CinR能够解除HipB对下游基因表达的抑制作用。
　　本论文的实验结果表明R.etli CFN42中的cin系统对其共生固氮以及胞外多糖的合成均有影响。

目录

声明

摘要

缩略语说明表

文献综述

一．细菌中的群体感应

1．Vibrio fischeri中的群体感应系统

2．Rhizobium etli CFN42中的群体感应系统

二．根瘤菌的共生固氮

1．根瘤的形成

2．结瘤因子(Nod factors)

3．根瘤的形成需要胞外多糖

三．根瘤菌中的胞外多糖

1．根瘤菌胞外多糖的结构

2．参与根瘤菌胞外多糖合成的基因

3．根瘤菌胞外多糖合成的调控

第一章 R．etli CFN42 cin系统影响共生固氮能力的研究

1．材料与方法

1．1 供试材料

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 R．etli在蛭石和土壤中的定殖情况

2．2 R．etli CFN42在蛭石中的共生固氮情况

2．3 R．etli CFN42在草坪土中的共生结瘤情况

2．4 R．etli CFN42在含有大量根瘤菌的三叶草土中的竞争结瘤情况

3．小结与讨论

第二章 R．etli CFN42群体感应系统中cin系统调控胞外多糖形成的研究

第一节 cin系统调控胞外多糖产量的研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第二节 cin系统影响R．etli CFN42“水滴状’’菌落形成的研究

1．材料与方法

2 结果与分析

3．小结与讨论

全文总结

本文创新点

参考文献

附录

攻读硕士期间所发表的论文

致谢