鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生虫，能够感染多种哺乳动物和鸟类，并引发弓形虫病(Toxoplasmosis)。全世界有近三分之一的人感染弓形虫。免疫功能不全的病人感染弓形虫后将会引起生命危险，先天性感染会引起胎儿流产或死胎。此外，一些精神疾病的发生也与弓形虫感染有关。弓形虫病对畜牧业的危害也很大，怀孕期间的羊和猪感染弓形虫后，经常导致流产、死胎，造成相当大的经济损失。
　　鸡作为弓形虫的一种不敏感宿主，一直以来鸡弓形虫病因为其大多数为隐性感染而未受到足够的重视。然而，散养鸡群的弓形虫感染率极高，加上弓形虫能够在鸡体内长时间存活，摄入被弓形虫污染的鸡肉可能会导致人和其他动物的感染。目前，有关鸡弓形虫病的研究主要集中在流行病学调查和基因型分析等方面。
　　然而，鸡的日龄与弓形虫感染之间的关系很少有报道。同时，有关鸡弓形虫病的药物治疗几乎没有报道。为了寻找最合适的日龄用于鸡弓形虫病模型的建立，在此基础上再进行治疗鸡弓形虫病的药物筛选，为鸡弓形虫病模型的建立和鸡弓形虫病的防治奠定基础，特进行了如下研究:
　　1.两种不同来源弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较
　　本研究拟通过弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较，探讨弓形虫的致病性与感染日龄的关系，确定用于急、慢性鸡弓形虫病模型建立最合适的日龄。分别用RH和JS两个弓形虫虫株的速殖子按照1×108个/羽的剂量腹腔感染7、14、21、28日龄雏鸡，同时设阴性对照组，仅注射生理盐水;攻虫后每日观察实验鸡的临床症状，记录每组鸡的死亡情况;利用ELISA方法检测各组实验鸡的弓形虫循环抗原(T.gondiicirculating antigens，TCA)和弓形虫循环抗体(T.gondii circulating antibodies，TCAb)，PCR方法对53天未死亡的鸡进行检测，对急性死亡和53天未死亡的鸡进行病理组织切片，观察组织病变。结果发现，7日龄组雏鸡感染弓形虫后多呈急性死亡，JS株的死亡率(100％)显著高于RH株(70％);14日龄组雏鸡感染后有轻微临床症状，但无死亡;21、28日龄组实验鸡感染JS株和RH株后均未出现临床症状和死亡。所有实验组的TCA和TCAb分别在感染后第4天和第11天转为阳性。21日龄组(RH株)和28日龄组的（RH株和JS株）的TCA和TCAb早于其它实验组降到阴性水平。7、14、21日龄组存活的鸡均可检测到弓形虫特异性DNA。28日龄组，RH株和JS株分别有3只和1只为PCR阴性。研究结果表明，雏鸡的日龄对弓形虫的致病性具有重要的影响，且日龄越小，弓形虫的致病性越强。7至14日龄的雏鸡可用于急性鸡弓形虫病模型的建立;14至28日龄的雏鸡可用于慢性鸡弓形虫病模型的建立。
　　2.鸡源弓形虫治疗药物的筛选
　　为了筛选能有效治疗鸡弓形虫病的药物，本研究首先利用ICR品系小鼠模型进行药物初筛，在此基础上，挑选抗小鼠弓形虫感染效果最好、中等、较差的三种药物或药物配伍治疗鸡弓形虫感染并做出合理评价。用刚地弓形虫RH和JS株速殖子，按1×104/鼠和1×108/鸡分别腹腔接种小鼠和鸡，接种后4h用药组通过灌服或饮水给药，连续用药5d，接种后20d或10d结束实验，根据存活率、平均存活时间等指标得出疗效。结果发现，在抗小鼠弓形虫感染试验中，磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组治疗效果最佳，阿奇霉素次之，其余药物抗弓形虫作用不明显。在抗鸡弓形虫感染试验中，阿奇霉素和磺胺氯呲嗪钠+甲氧苄啶组均能显著提高雏鸡的存活率，前者(44.4％)略高于磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组(33.3％)，但两者无明显差异(P＞0.05)。研究结果表明，阿奇霉素和磺胺氯吡嗪钠联合甲氧苄啶对鸡弓形虫感染有明显治疗效果。
　　弓形虫排泄分泌抗原(excretory/secretory antigens，ESA)在弓形虫入侵宿主的早期就开始分泌，在入侵过程中发挥重要作用。由于排泄分泌抗原具有很好的免疫原性，现已广泛用于弓形虫病的诊断。免疫排泄分泌抗原可诱导机体产生强烈的体液、细胞免疫应答反应，可用于弓形虫病的免疫预防。此外，ESA还具有抗肿瘤等重要作用。到目前为止，有关弓形虫排泄分泌抗原对宿主细胞的调节作用的研究还相对较少，对巨噬细胞的调节作用研究几乎没有;同时分析和鉴定结合宿主细胞的排泄分泌抗原，对于进一步理解排泄分泌抗原的功能以及其如何发挥作用的机制是至关重要的。因此，我们进行了以下研究:
　　3.弓形虫排泄分泌抗原对小鼠巨噬细胞免疫功能调节研究
　　本部分研究旨在观察弓形虫排泄分泌抗原对小鼠单核巨噬细胞Ana-1免疫功能的影响。用不同浓度的弓形虫排泄分泌抗原分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养，观察不同处理对Ana-1细胞增殖和吞噬的影响，用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表达，并用流式细胞术检测作用后的Ana-1细胞表面Toll样受体分子表达水平的变化以及是否促进细胞的凋亡。结果显示，弓形虫排泄分泌抗原能够显著抑制小鼠巨噬细胞的增殖和吞噬功能，并显著诱导细胞产生凋亡。ESA作用Ana-1巨噬细胞后，下调了细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，同时上调了细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。ESA作用Ana-1巨噬细胞后，Ana-1细胞表面的Toll样受体2和4的活化受到抑制，NO的分泌也受到抑制。此外，弓形虫ESA可以抑制LPS诱导的Ana-1巨噬细胞中NF-κB的激活。结果表明，弓形虫ESA在体外可显著调节Ana-1细胞的免疫功能。
　　4.弓形虫排泄分泌抗原小鼠巨噬细胞结合分子的鉴定
　　本研究的目的是鉴定刚地弓形虫排泄分泌抗原中能与小鼠巨噬细胞(Ana-1细胞)结合的分子，并分析其蛋白功能。ESA与Ana-1细胞孵育后，免疫荧光试验检测ESA与Ana-1细胞的结合情况。通过免疫共沉淀试验来收集与Ana-1细胞结合的ESA，用鸟枪法——液相色谱质谱/质谱联用(shotgun LC-MS/MS)进行蛋白的质谱鉴定，并用生物信息学分析其功能。结果表明，ESA能够结合到Ana-1细胞的表面，其中共有109种弓形虫蛋白被鉴定。生物信息学分析显示，共有57种蛋白被成功功能注释，其中40种(70.2％)蛋白有结合活性，31种(54.4％)蛋白有催化活性。这些蛋白可能参与到宿主细胞的入侵以及宿主细胞的功能调节过程中。这些研究结果为我们进一步了解弓形虫和宿主细胞——巨噬细胞之间的相互作用关系奠定基础，同时也为更好的阐明弓形虫致病的分子机制提供依据。
　　5.刚地弓形虫TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究
　　从上述鉴定的蛋白中选取弓形虫延伸因子-1α(elongation factor-1 alpha，EF-1α)和10 kDa排泄分泌抗原(10 kDa excretory-secretory antigen，ESA10)，进行TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究。利用PCR技术扩增到TgEF-1α基因(GenBank accession: XM_002370208.1)和TgESA10基因(GenBank accession:HM014013.1)。序列分析表明TgEF-1α基因的ORF含1347 bp，编码448个氨基酸，理论分子量49.04 kDa; TgESA10基因的ORF含390 bp，编码130个氨基酸，理论分子量14.69 kDa。构建原核表达质粒pET32a(+)-EF-1α和pET32a(+)-ESA10，均在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得了表达，重组蛋白rTgEF-1α以包涵体形式存在，重组蛋白rTgESA10存在于上清中。Western印迹显示表达的重组蛋白rTgEF-1α和rTgESA10，均能被感染弓形虫的鸡血清所识别，并且能检测到天然状态下这两种蛋白的存在。小鼠分别被动免疫抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体后感染弓形虫速殖子，小鼠的存活时间均显著延长。分别用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体作用过的弓形虫速殖子感染小鼠后，小鼠的存活时间均显著延长;分别用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体作用过的弓形虫速殖子感染小鼠巨噬细胞，阳性巨噬细胞感染数和细胞内速殖子量均显著减少。动物保护实验的结果显示，BALB/c小鼠免疫重组蛋白rTgEF-1α和rTgESA10后，小鼠体内均产生高水平的抗弓形虫抗体、干扰素-γ、白细胞介素-4;CD4+和CD8+T细胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表达水平显著增加(P＜0.05);感染弓形虫RH株速殖子后，对照组小鼠均在8天之内死亡，rTgEF-1α蛋白免疫组小鼠的存活时间显著延长至14.53±1.72天(P＜0.05)，rTgESA10蛋白免疫组小鼠的存活时间显著延长至14.13±1.63天(P＜0.05)。这些结果表明，TgEF-1α和TgESA10均在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用，并能够激起小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，可以作为预防治疗弓形虫病的蛋白疫苗候选分子。
　　6.刚地弓形虫TgEF-1α基因和TgESA10基因DNA疫苗的构建及免疫保护性研究
　　本部分研究分别构建了弓形虫pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10 DNA疫苗，并评价了其对急性弓形虫病的免疫保护性。结果发现，单独免疫pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10的小鼠，体内均产生高水平的抗弓形虫抗体、干扰素-γ、白细胞介素-4和白细胞介素-17;CD4+和CD8+T细胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表达水平均显著增加(P＜0.05)。感染弓形虫RH株速殖子后，对照组小鼠均在8天之内死亡，pVAX-EF-1α免疫组小鼠的存活时间显著延长至14.1±1.7天(P＜0.05)，pVAX-ESA10免疫组小鼠的存活时间显著延长至14.3±1.7天(P＜0.05)。这些结果表明，DNA疫苗pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10均能够激起小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，并且对小鼠急性弓形虫感染产生部分免疫保护力，这表明TgEF-1α和TgESA10可以作为预防治疗弓形虫病的DNA疫苗候选分子。
　　7.四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1调节小鼠巨噬细胞免疫功能的研究
　　本部分研究先进行了弓形虫钙依赖蛋白激酶1(calcium-dependent protein kinase1，CDPK1)和14-3-3蛋白(14-3-3)的基因克隆、表达和纯化，然后观察四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对小鼠单核巨噬细胞Ana-1免疫功能的影响。分别用不同浓度的rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养，观察不同处理对Ana-1细胞增殖和吞噬的影响，用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表达，并用流式细胞术检测作用后的Ana-1细胞表面Toll样受体分子表达水平的变化以及是否促进细胞的凋亡。结果显示，rTgESA10、rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激Ana-1细胞后，细胞的增殖均受到显著抑制;rTgEF-1α对Ana-1细胞的增殖活性几乎没有影响。Ana-1细胞经rTgESA10刺激后，细胞吞噬FITC-dextran的能力显著增加;经rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激后，细胞吞噬FITC-dextran的能力均显著下降;rTgEF-1α对Ana-1细胞吞噬功能的影响较小。高浓度的rTgESA10和不同浓度的rTg14-3-3和rTgCDPK1均可以显著诱导Ana-1细胞发生早期凋亡和晚期凋亡;rTgEF-1α对细胞凋亡没有明显影响。高浓度的rTgESA10和不同浓度的rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1作用Ana-1巨噬细胞后，均促进了细胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10的分泌。除个别剂量组外，四种重组蛋白均能活化Ana-1细胞表面的TLR2，rTgESA10和rTgEF-1α均能活化Ana-1细胞表面的TLR4。结果表明，四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1在体外均可显著调节Ana-1细胞的免疫功能。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

前言

参考文献

第一章 鸡弓形虫病的研究进展

1 弓形虫的生活史

2 鸡是弓形虫重要的中间宿主

3 鸡弓形虫病的流行情况

4 自然感染的鸡弓形虫病临床症状

5 鸡弓形虫病实验模型的建立

6 鸡弓形虫病的诊断方法

6．1 血清学诊断

6．2 分子生物学诊断方法

7 鸡源弓形虫虫株的分离及基因型分析

7．1 鸡源弓形虫虫株的分离

7．2 基因型分析方法

7．3 基因型的变异性

8 小结

参考文献

第二章 弓形虫排泄分泌抗原研究进展

1 ESA的制备

1．1 从实验感染鼠的腹水中分离

1．2 弓形虫的细胞培养

1．3 弓形虫的无细胞培养

2 ESA的组成和免疫原性

2．1 体内排泄分泌抗原

2．2 体外排泄分泌抗原

3 ESA应用于弓形虫病的诊断

4 ESA的免疫功能及应用

5 ESA对宿主细胞的调节作用

5．1 树突状细胞

5．2 T细胞

6 ESA的抗肿瘤作用

7 小结

参考文献

第三章 两种不同来源弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 攻虫后试验动物死亡情况

2．2 触片检查结果

2．3 循环抗原(TCA)与循环抗体(TCAb)的变化

2．4 PCR检测结果

2．5 脏器组织病理学变化

3 讨论

参考文献

第四章 鸡源弓形虫治疗药物的筛选

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 RH株感染小鼠试验

2．2 JS株感染小鼠试验

2．3 JS株感染雏鸡试验

3 讨论

参考文献

第五章 弓形虫ESA对小鼠巨噬细胞的免疫功能调节研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 弓形虫速殖子的纯化

2．2 ESA的SDS-PAGE结果分析

2．3 细胞增殖试验

2．4 ESA对细胞吞噬功能的影响

2．5 ESA促进Ana-1细胞的凋亡

2．6 ELISA分析弓形虫ESA对Ana-1巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响

2．7 NO的检测

2．8 TLR2和TLR4的检测

2．9 弓形虫ESA对巨噬细胞NF-κB信号通路的影响

3 讨论

参考文献

第六章 弓形虫排泄分泌抗原小鼠巨噬细胞结合分子的鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 Western blot分析

2．2 ESA与Ana-1细胞的结合

2．3 LC-MS／MS分析和鉴定结合Ana-1细胞的弓形虫ESA蛋白

2．4 生物信息学分析

3 讨论

参考文献

第七章 刚地弓形虫TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 RT-PCR的扩增

2．2 质粒pMD19-T-TgEF-1α和pMD19-T-TgESA10的构建和鉴定

2．3 重组表达质粒pET-32(+)-EF-1α和pET-32(+)-ESA10的构建和鉴定

2．4 重组蛋白的表达与纯化

2．5 Western Blot分析

2．6 抗体中和试验结果

2．7 被动免疫试验结果

2．8 BALB／c小鼠的免疫保护试验结果

3 讨论

参考文献

第八章 刚地弓形虫TgEF-1α基因和TgESA10基因DNA疫苗的构建及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 DNA疫苗pVAX-TgEF-1α和pVAX-TgESA10的构建和鉴定

2．2 Western Blot检测

2．3 小鼠血清中抗弓形虫特异性抗体的检测

2．4 小鼠血清中细胞因子的检测

2．5 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表达水平的检测

2．6 攻虫试验结果

3 讨论

参考文献

第九章 刚地弓形虫钙依赖蛋白激酶1和14-3-3蛋白的基因克隆及原核表达

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 RT-PCR的扩增

2．2 质粒pMD19-T-TgCDPK1和pMD19-T-Tg14-3-3的构建和鉴定

2．3 重组表达质粒pET-32a(+)-CDPK1和pET-32a(+)-14-3-3的构建和鉴定

2．4 重组蛋白的表达与纯化

2．5 Western Blot分析

3 讨论

参考文献

第十章 四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1调节小鼠巨噬细胞免疫功能的研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 rTgESA10、rTgEF-1α、rTgCDPK1和rT914-3-3与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合

2．2 细胞增殖试验

2．3 rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对细胞吞噬功能的影响

2．4 rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对Ana-1细胞凋亡的影响

2．5 ELISA分析rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对Ana-1巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响

2．6 TLR2和TLR4的检测

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

在读期间发表的论文