大豆疫霉定量磷酸化蛋白质组学的分析和PsMPK7功能分析及互作蛋白的筛选

摘要

大豆疫霉（Phytophthora sojae）是植物病原卵菌的代表性物种之一，它引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，每年给全球大豆生产造成上几十亿美元的经济损失。大豆疫霉虽然在菌丝形状上与低等真菌相似，但在进化关系上却与真菌相差甚远，在致病机制上与真菌存在很大差异。因此，研究疫霉菌相对独特的致病分子机制，将有利于设计与开发特异的作物疫病防控药剂。
　　由于疫霉菌的遗传操作较为困难，利用传统的功能基因的研究方法耗时耗力、成本高、效率低。因此我们借助高通量的蛋白组学与转录组学分析，来帮助我们提高鉴定重要基因的效率。本研究首先对大豆疫霉菌丝阶段、孢子囊阶段以及菌丝侵染大豆阶段进行了磷酸化蛋白组的测定，获得了许多在孢子囊阶段或侵染阶段被磷酸化的蛋白质。在此基础上，发现大豆疫霉中的一个在菌丝阶段、侵染阶段以及孢子囊阶段都能被磷酸化的MAPK蛋白，即PsMPK7。为了研究该基因的功能，首先对该基因的模型进行校正后，对PsMPK7进行基因沉默，发现了该基因不仅参与大豆疫霉的致病力、有性生殖以及对外界胁迫的应答之外，而且影响了胞外的漆酶活性。用酵母双杂交与亲和纯化的方法对其互作蛋白进行了筛选与验证。本文主要内容如下:
　　大豆疫霉菌丝、孢子囊以及侵染大豆阶段的定量磷酸化组数据分析:对本次定量磷酸化蛋白组数据分析后发现，侵染阶段共鉴定到4577个磷酸化位点，孢子囊阶段共鉴定到3353个磷酸化位点。在菌丝阶段与侵染阶段的混合样品中共检测到42个效应分子（包括28个RxLR，5个NLP，7个CRN和2个elicitin类效应分子），同时鉴定到14个ABC转运蛋白、20个转录因子以及107个蛋白激酶等被磷酸化。在菌丝阶段和孢子囊阶段的混合样品中鉴定到16个效应分子（1个NLP和15个RxLR类效应分子）、9个ABC转运蛋白、15个转录因子以及47个蛋白激酶被磷酸化。对其磷酸化水平进行分析后发现，侵染阶段、孢子囊阶段的菌丝与菌丝阶段相比，有的蛋白磷酸化的水平发生了变化，有的并未变化，还有的蛋白只在混合样品中的一个阶段被磷酸化，而无法对其磷酸化水平进行定量。本研究率先对大豆疫霉被磷酸化的蛋白进行了定量磷酸化组鉴定，结果为研究植物病原卵菌与寄主的互作提供了基础数据。
　　PsMPK7的功能分析及互作蛋白的筛选:在定量磷酸化蛋白质组中，检测到了PsMPK7在菌丝阶段、孢子囊阶段和侵染阶段都被磷酸化。PsMPK7在转录组中显示在游动孢子，休止胞以及休止胞萌发阶段均上调表达。将PsMPK7的基因模型校正清楚之后，利用基因沉默的方法对PsMPK7的功能进行了研究，结果发现PsMPK7沉默后致病力减弱，卵孢子产量下降，而且突变体影响了菌株对外界胁迫的耐受性。本研究我们发现该基因的沉默也影响了漆酶的活性。我们用酵母双杂交的方法分别验证了4个MEK与PsMPK7激酶区域的互作，发现彼此都不互作。但这并不意味着它们真的就不互作，产生这种结果的原因可能有:1.大豆疫霉中MEK与MAPK的磷酸化互作只是瞬时的，用酵母双杂交这种体系不适合验证它们之间短暂瞬时的互作;2.大豆疫霉的MAPK和MEK之间不存在直接互作关系，在大豆疫霉MAPK信号通路中有可能存在某些中间蛋白参与到两者的互作中;3.不完整的蛋白也有可能是它们被验证不互作的原因。接下来将基因的全长连上3xFlag标签，通过亲和纯化的方法在大豆疫霉的体内筛选与之互作的蛋白。鉴定到的113个蛋白，包括:蛋白激酶、14-3-3类蛋白、actin蛋白等。由于时间有限，候选蛋白与PsMPK7的互作及其生物学意义还有待进一步验证和解析。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 定量磷酸化蛋白组研究进展

1 蛋白质磷酸化的重要性

2 磷酸化组学在植物中的应用

3 磷酸化蛋白质组学的研究技术与进展

4 定量磷酸化蛋白质组学研究的主要方法

5 定量磷酸化蛋白质组学总结与展望

参考文献

下篇 研究内容

第一章 大豆疫霉侵染阶段和孢子囊阶段定量磷酸化蛋白组数据的测定与分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 大豆疫霉PsMPK7功能分析及互作蛋白的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

攻读硕士期间发表的研究论文

致谢