麦草畏降解菌Sphingomonas sp.Ndbn--20的分离鉴定及其生物学特性研究

摘要

麦草畏是一种低毒、高效、广谱的选择性除草剂，主要用于防除玉米和谷物农田中的一年生及多年生阔叶杂草。麦草畏微生物降解过程中的脱甲基酶是生产抗麦草畏转基因农作物的靶标酶，在生产应用方面具有重要意义。本文旨在分离一株具有从未报道过的麦草畏脱甲基酶的麦草畏降解菌株，研究其进化地位、生物学特性和麦草畏降解特性，初步研究其麦草畏脱甲基机制，为进一步研究其麦草畏降解机制，克隆相关降解基因提供理论依据。 采用富集培养的方法从堆肥中分离到1株能以为麦草畏为唯一碳源生长的细菌Ndbn-20（16S rDNA GenBank登陆号:KP064570）。根据菌株Ndbn-20的形态特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列相似性分析将其鉴定为Sphingomonas sp.。对菌株的生物学特性和降解特性研究表明，菌株Ndbn-20的最佳生长条件为:温度30℃、pH7.0。Ndbn-20为好氧性生长，随着通气量的降低，菌株的生长量减小。Ndbn-20在NaCl浓度范围为0.5-3％时生长较好。菌株Ndbn-20降解麦草畏的最适条件为:pH7.0、温度30℃。Ndbn-20在72h内可以完全矿化100mg·L-1的麦草畏，当培养时间达到108h时，对较高浓度(200mg·L-1)的麦草畏也能将其完全降解。采用HPLC和LC-MS/MS对菌株Ndbn-20降解麦草畏的中间代谢产物进行测定，结果表明Ndbn-20降解麦草畏的主要中间代谢产物是脱甲基形成的DCSA。 Ndbn-10是本实验室从麦草畏生产厂家的水处理系统的活性污泥中分离到的一株能扩增出麦草畏脱甲基酶基因DMO的麦草畏降解菌株。以菌株Ndbn-10作为对照，根据已报道的DMO基因序列设计了四对引物，同时在两株菌中扩增DMO基因片段，结果却没能从麦草畏降解菌株Ndbn-20中扩增到相应的DMO基因片段。研究发现Ndbn-20的无细胞抽提液无需NADH提供还原力，并且只在有氧和四氢叶酸存在的条件下才具有麦草畏脱甲基酶活性。这些结果表明Ndbn-20的麦草畏脱甲基酶是需氧的四氢叶酸依赖型脱甲基酶，为一个从未报道过的麦草畏脱甲基酶。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章文献综述

1麦草畏的应用及其污染

2麦草畏的微生物降解

3麦草畏微生物降解过程中的脱甲基酶

4转基因植物综述

5研究的技术路线

6本研究的目的和内容

第二章麦草畏降解菌Ndbn-20的分离与鉴定

1材料与方法

1．1菌株、培养基与试剂

1．2降解菌株的富集与分离

1．3降解菌株的培养特征及生理生化鉴定

1．4降解菌株的16S rDNA基因序列的测定

1．5降解菌株系统发育地位的确定

1．6麦草畏含量的测定

1．7菌体生长量的测定

1．8种子液培养

2结果与分析

2．1 堆肥样品中麦草畏降解菌株的分离

2．2降解菌株Ndbn-20的菌落形态及生理生化特征

2．3 降解菌株Ndbn-20的鉴定结果

2．4环境条件对降解菌株Ndbn-20生长的影响

3 本章小结

参考文献

第三章菌株Ndbn-20的麦草畏降解特性研究

1材料与方法

1．1培养基与试剂

1．2菌体生长量的测定

1．3菌株Ndbn-20麦草畏降解特性的研究

2结果与分析

2．2温度对菌株Ndbn-20降解麦草畏的影响

2．3 pH对菌株Ndbn-20降解麦草畏的影响

2．4接种量对菌株Ndbn-20降解麦草畏的影响

2．5底物起始浓度对菌株Ndbn-20降解麦草畏的影响

3本章小结

参考文献

第四章菌株Ndbn-20脱甲基机制的初步研究

1材料与方法

1．1培养基与试剂

1．2麦草畏及DCSA的测定

1．4菌株Ndbn-20脱甲基酶的酶活分析

2结果与分析

2．1 麦草畏及其主要中间代谢产物DCSA的测定

2．2 PCR法扩增菌株Ndbn-20的DMO基因片段

2．3 菌株Ndbn-20脱甲基酶的酶活分析

3 本章小结

参考文献

全文总结

本文的创新点

本文的不足之处

附录

攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文

致谢