两株盐生海芦笋内生真菌分离鉴定及其次级代谢产物研究

摘要

微生物次级代谢产物一直是天然产物研究领域的热点之一，许多具有重要应用价值的化合物发现于微生物次级代谢产物，但是随着研究的深入，发现新化合物的概率逐渐减小，迫切需要采用新技术、新方法来寻找新的天然产物。近年来，随着分子生物学的发展，基于聚酮合酶（polyketide synthases,PKS）功能基因的定向筛选技术已经成为发现微生物源新型化合物的重要策略。
　　本研究采用平板划线分离和斜面纯化技术从盐生海芦笋中分离到24株内生真菌，以PKS功能基因为靶点，运用PCR扩增技术筛选出4株内生真菌含有PKS基因，编号分别为Salicorn9、Salicorn13、Salicorn19和Salicorn46。在此基础上，采用形态学和分子生物学方法将这些菌株分别鉴定为:链格孢菌（Alternaria alternata）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、柑桔青霉菌（Penicillium citrinum）。对菌株Salicorn19和Salicorn46分别进行液体发酵，并探索使用添加金属离子的方法激活菌株Salicorn46的沉默基因，以期发现结构新颖的化合物。
　　采用溶剂萃取，多种柱层析分离纯化（减压柱层析、常压柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱等），结合现代波谱学(1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、MS、IR、UV、CD等）分析，从Salicorn19氯仿粗提物中分离鉴定了4个化合物，分别为:cerebrosideC(1)、fusartricin(2)、fusarielinB(3)和enniatinB(4)，其中化合物2为新化合物。从菌株Salicorn46的发酵产物中分离鉴定了7个化合物，分别为:alternaroside B(5)、(3β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,22-dien-3-ol(6)、citrinin(7)、pencitrin1(8)、pencitrin2(9)、penicitrinone A(10)、penicitrinoneE(11)，其中化合物8和9为新化合物，并通过量子化学理论计算与实际CD谱的比较，确定了化合物9-11的绝对构型。
　　采用DPPH法对化合物的抗氧化活性进行了初步评价，结果表明:penicitrinone E(11)具有弱的清除DPPH自由基的能力，IC50为94.66μM，其它化合物没有抗氧化活性。MTT法对化合物10和化合物11进行体外抗肿瘤活性评价，其中化合物10对癌细胞A549和HepG-2的增殖有明显的抑制作用，EC50值分别为40.47和53.57μM。

目录

声明

摘要

中英文缩略词索引

第一章 文献综述

1．1 植物内生真菌

1．1．1 植物内生真菌简介

1．1．2 内生真菌生物活性代谢产物的研究

1．2 现代生物技术在内生真菌次级代谢产物研究中的应用

1．2．1 真菌聚酮合酶PKS简介

1．2．2 真菌聚酮合酶PKS的研究现状

1．3 天然产物绝对构型的确定

1．3．1 天然产物绝对构型确定的一般方法

1．3．2 圆二色谱在天然产物绝对构型中的应用

1．4 选题依据

第二章 盐生海芦笋内生真菌的分离筛选以及鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 筛选的Ⅰ型PKS基因型内生真菌

2．2．2 菌株的形态学鉴定

2．2．3 菌株的分子生物学鉴定

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 菌株S19次级代谢产物研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 次级代谢产物结构解析

3．2．2 次级代谢产物波谱数据

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 菌株S46次级代谢产物研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 金属离子Cu2+对菌株S46次级代谢产物影响的定性分析

4．2．2 次级代谢产物结构解析

4．2．3 次级代谢产物波谱数据

4．2．4 化合物9-11绝对构型的确定

4．3 讨论

4．4 本章小结

第五章 两株盐生海芦笋内生真菌次级代谢产物生物活性的研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料与试剂

5．1．2 仪器与设备

5．1．3 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 抗氧化活性评价

5．2．2 体外抗肿瘤活性评价

5．3 讨论

5．4 本章小结

参考文献

附录

全文结论

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文