镰孢红素酮对肾脏细胞的毒性机制及辅酶Q10对其保护效应的研究

摘要

镰孢红素酮(Fusarochromanone，FC101)，是由镰刀茵属木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)产生的一种真菌毒素，广泛存在于动物饲料、粮食及农作物中。畜禽持续摄入被FC101污染的食物及饲料后，可能会出现急性症状，也可能导致严重的慢性病变，最终引发癌症，从而给畜禽业造成重大的经济损失。尽管有一些研究对FC101危害人类及动物健康的毒性机制进行探索，但是FC101毒素的毒性机理尚未明确。本研究发现FC101可能通过阻滞细胞于G1期，抑制细胞增殖，引起肾脏细胞COS7，HEK293的毒性作用，并且可能通过caspase依赖和非依赖两种方式引起肾脏细胞死亡。通过进一步探讨FC101引起细胞死亡的分子机制，我们发现FC101可诱导ROS产生，ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。此外FC101诱导氧化应激产生细胞毒性可能涉及到了ROS介导的FC101下调PP2A，PP5蛋白表达水平，从而导致JNK通路激活。辅酶Q10(CoQ10)是呼吸链的重要成员之一，它与线粒体内膜相结合，参与细胞氧化磷酸化及ATP生成过程，是细胞自身的天然抗氧化剂，细胞代谢的激活剂。目前临床上CoQ10主要应用于急、慢性充血性心力衰竭，病毒性肝炎和癌症的辅助治疗。CoQ10在ROS造成的损伤下可保护并增强细胞功能。但是关于CoQ10在FC101诱导肾脏细胞死亡中的作用尚未见报道。本实验将探究FC101对肾脏细胞的毒性机制及CoQ10对其的保护效应。试验分为以下四个部分:
　　1.FC101对肾脏细胞周期分布的影响及其机制探讨FC101对肾脏细胞COS7，HEK293的毒性效应。以COS7，HEK293细胞为细胞模型，FC101(0～5μM)单独处理细胞6天或者24～72h，在倒置相差显微镜下分析细胞形态，one-solution实验测定细胞存活率，流式细胞术检测细胞周期，Western Blot实验分析细胞周期蛋白变化。我们发现，细胞经不同浓度的FC101(0～5μM)处理6天后，细胞细胞密度及个数明显减少，细胞增殖减慢，细胞形态学发生改变，表现为贴壁细胞变圆、皱缩、脱落、细胞体积变小。FC101以浓度依赖方式抑制肾脏细胞COS7，HEK293增殖，诱导细胞死亡。此外，当细胞暴露于FC101时间为24～72小时后，one-solution检测法结果显示FC101降低细胞活性。流式细胞术检测显示，细胞经FC101处理24小时后，细胞停滞在G0/G1期的比例从33.2％上升到57.4％，FC101呈剂量依赖性阻滞细胞周期于G0/G1期。此外，用1μM浓度的FC101分别处理细胞24小时，48小时，72小时后，FC101呈时间依赖性阻滞细胞于G0/G1期。同时，FC101呈剂量依赖性和时间依赖性下调细胞周期相关蛋白CyclinD1，细胞周期依赖性激酶(CDK4和CDK6)，细胞周期调控因子Cdc25A的表达，同时上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子(p21 Cip1，p27Kip1)的表达，进而导致Rb去磷酸化。结果表明，FC101通过下调细胞周期调控因子CyclinD1、CDK4、CDK6、Cdc25A、p-Rb，上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21Cip1，p27 Kip1的表达进而阻滞细胞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖，引起细胞毒性作用。
　　2.FC101对肾脏细胞凋亡和自噬的影响探究FC101如何诱导细胞死亡以及FC101诱导细胞死亡的分子机制。以COS7，HEK293细胞为细胞模型，FC101(0～5μM)单独处理细胞或者使用泛caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)、自噬抑制剂(CQ)、ROS清除剂(NAC)预处理细胞后联用FC101(0～5μM)处理0～72小时;采用腺病毒Ad-GFP-LC3感染COS7细胞24小时后，再用FC101处理24小时。Trypan blue拒染法检测细胞死亡率、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术和DAPI染色检测细胞凋亡、免疫荧光染色法检测自噬、CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧(ROS)的生成、Caspase-3/7 Assay试剂盒检测Caspase-3/7活性，Western Blot分析BAD、BAX、BAK、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、survivin、DR5、cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved PARP、AIF、LC3A/B、H2A、γ-H2AX(ser139)、p53、ATM、phospho-ATM(ser1981)、ATR、phospho-ATR(ser428)、NFκB(p65)，phospho-NFκB(p65)(Ser139)蛋白表达及活性表现。我们发现，FC101呈剂量依赖和时间依赖方式引起细胞死亡。同时FC101呈浓度依赖方式上调促凋亡蛋白BAD及外部死亡受体通路蛋白DR5的表达，下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin表达，提高cleaved caspase8蛋白表达量及活化caspase3，并以浓度依赖方式造成PARP裂解。但是并未显著引起促凋亡基因BAK和BAX的表达变化。此外，细胞经FC101处理后，激光共聚焦荧光显微镜观察下发现，细胞核经DAPI染色后出现核皱缩，核碎裂，染色质聚集等凋亡特征，我们还发现FC101诱导凋亡诱导因子AIF发生核移位，AIF由胞质转移至细胞核。并且FC101诱导细胞发生自噬，表现为自噬相关蛋白LC3Ⅱ颗粒聚集程度增加，LC3Ⅱ蛋白表达量提高，使用自噬抑制剂氯喹(CQ)处理细胞后，通过one-solution实验分析可知自噬抑制剂CQ显著提高细胞存活率，减轻FC101对细胞的毒性作用。另外，使用特异性荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内ROS的生成发现FC101引起细胞内ROS水平呈浓度依赖性和时间依赖性升高。激光共聚焦荧光观测结果显示ROS清除剂NAC可使细胞核碎裂减少，保持胞核完整性，减少凋亡细胞数量。NAC显著降低胞质内LC3Ⅱ颗粒聚集程度。同样NAC降低促凋亡蛋白BAD，cleavedcaspase3的蛋白表达量，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达量。此外，FC101以浓度依赖方式激活NFκB、P53，并且引起DNA损伤蛋白H2AX和ATM磷酸化表达水平升高。结果表明，FC101诱导COS7、HEK293细胞发生凋亡及自噬，引起细胞死亡，机制上可能涉及NFκB和p53信号转导。并且FC101诱导ROS产生，ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。此外FC101可能造成DNA损伤。
　　3.氧化应激和JNK信号通路介导的FC101诱导肾脏细胞毒性机制研究探讨FC101致肾脏细胞COS7，HEK293死亡的毒性机制及涉及到的相关信号通路。COS7和HEK293细胞为细胞模型，FC101(0～5μM)单独处理或使用ROS清除剂(NAC)，JNK抑制剂SP600125预处理细胞1小时后联用FC101(0～5μM)处理24小时;采用腺病毒干扰，过表达c-Jun、PP2A、PP5后，经FC101(0.5，1μM)处理24小时。CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧(ROS)生成，倒置相差显微镜下分析细胞形态，one-solution实验测定细胞存活率，Western Blot分析MAPK信号通路中MAPK(Erk1/2、JNK、p38)和蛋白磷酸酶(PP2A，PP5)的表达水平。我们发现，FC101诱导ROS产生，激活JNK信号通路，使用JNK抑制剂(SP600125)或者使用腺病毒过表达c-Jun后可削弱FC101对细胞的毒性。N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)预处理后可明显清除FC101诱导下的ROS产生。此外，ROS抑制JNK通路激活，减轻细胞毒性。FC101引起ROS水平升高，降低丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)的表达量，NAC则阻止FC101下调蛋白磷酸酶PP2A,PP5的表达量。此外，过表达PP2A，PP5可抑制JNK磷酸化以及减轻细胞毒性。结果表明，FC101通过诱导ROS，下调蛋白磷酸酶PP2A，PP5的表达，进而激活JNK通路引起肾脏细胞毒性作用。
　　4.C0Q10通过抑制氧化应激及JNK通路保护FC101诱导COS7细胞毒性探讨CoQ10对于FC101损伤细胞后的保护作用及其保护机制。本实验以COS7细胞作为细胞模型，使用FC101(0～5μM)单独处理或者使用CoQ10，或JNK抑制剂SP600125预处理细胞1小时或30分钟后，联用FC101(0～5μM)处理6天或24小时;采用腺病毒干扰，过表达c-Jun后，细胞经CoQ10预处理1小时，再用FC101(1μM)处理24小时。CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧(ROS)的生成，倒置相差显微镜下分析细胞形态，one-solution实验测定细胞活性，Western Blot分析c-Jun、Bad、Bcl-xL和cleaved-caspase3的表达水平。我们发现，FC101通过诱导ROS引起细胞凋亡，CoQ10可通过阻止ROS产生，进而抑制细胞凋亡。CoQ10可显著削弱FC101诱导下的细胞活性降低，并且CoQ10恢复细胞形态学，抑制细胞核皱缩及碎裂。CoQ10可减少Bad的表达水平、提高Bcl-xL的的表达水平、降低caspase-3的活性。此外，CoQ10抑制JNK通路激活。使用JNK抑制剂(SP600125)或腺病毒过表达c-Jun则增强CoQ10削弱FC101诱导下的细胞毒性。结果表明，FC101诱导氧化应激产生细胞毒性，CoQ10通过抑制ROS及JNK通路从而保护FC101诱导下的细胞损伤。

目录

声明

论文说明

摘要

符号及缩略语

引言

第一章 镰孢红素酮的毒性研究进展

1 镰孢红素酮概况

2 镰孢红素酮的污染来源

3 镰孢红素酮对动物体危害

4 镰孢红素酮毒性及其毒性作用机理

参考文献

第二章 凋亡，自噬及其信号通路研究进展

1 细胞凋亡及其分子机制

2 细胞自噬过程及其分子机制

3 与凋亡、自噬有关的信号通路

4 细胞凋亡和自噬的关系

参考文献

第三章 CoQ10抗氧化应激及其对机体的保护作用

1 氢化应激作用机和

2 ROS与细胞内信号转导

3 CoQ10对机体的保护作用

参考文献

第四章 FC101对肾脏细胞周期分布的影响及其机制

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 细胞

1．3 仪器

1．4 细胞培养

1．5 细胞形态学与细胞计数分析

1．6 细胞增殖分析

1．7 流式细胞术检测细胞周期变化

1．8 蛋白免疫印记(Western blot)分析

1．9 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 FC101抑制细胞增殖，降低细胞活性

2．2 FC101诱导细胞G0／G1期阻滞

2．3 FC101下调细胞周期调控因子cyclin D1，CDK4／6和Cdc25A， 同时上调周期抑制因子(p21Cipl，p27Kipl)的表达，导致Rb去磷酸化

3 讨论

参考文献

第五章 FC101对肾脏细胞凋亡和自噬的影响

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 细胞

1．3 仪器

1．4 细胞培养

1．5 台盼蓝拒染法检测细胞死亡率

1．6 Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

1．7 DAPI染色检测细胞凋亡

1．8 Caspase-3／7活性检测

1．9 免疫荧光染色法检测自噬

1．10 one solution单溶液检测法

1．11 ROS检测法

1．12 蛋白免疫印记(Western blot)分析

1．13 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 FC101通过下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL和survivin，上调促凋亡蛋白BAD和DR5的表达，诱导细胞凋亡

2．2 FC101不完全依赖caspase凋亡途径引起细胞死亡

2．3 FC101诱导核转录因子AIF发生核移位

2．4 FC101诱导细胞自噬，抑制细胞存活

2．5 ROS介导FC101诱导细胞凋亡和自噬

2．6 FC101诱导ROS活化核转录因子NFκB

2．7 FC101调控DNA损伤相关蛋白的的表达

2．8 FC101调控p53表达

3 讨论

参考文献

第六章 氧化应激和JNK信号通路介导的FC101诱导肾脏细胞毒性机制研究

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 细胞

1．3 仪器

1．4 细胞培养

1．5 ROS检测

1．6 细胞形态学与细胞计数分析

1．7 细胞活性分析

1．8 蛋白免疫印记(Westem blot)分析

1．9 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 NAC阻止FC101诱导ROS产生

2．2 FC101诱导COS7和HEK293细胞内ROS产生，激活JNK通路

2．3 ROS介导FC101抑制蛋白磷酸酶的表达

2．4 蛋白磷酸酶PP2A，PP5过表达削弱FC101激活JNK通路和细胞毒性作用

3 讨论

参考文献

第七章 CoQ10通过抑制氧化应激及JNK通路保护FC101诱导COS7细胞损伤

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 细胞

1．3 仪器

1．4 细胞培养

1．5 细胞形态学分析

1．6 细胞活性分析

1．7 ROS检测

1．8 Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

1．9 DAPI染色检测细胞凋亡

1．10 蛋白免疫印记(Western blot)分析

1．11 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 CoQ10保护FC101致COS7肾脏细胞损伤

2．2 CoQ10抑制FC101诱导ROS产生

2．3 CoQ10抑制FC101诱导COS7肾脏细胞凋亡

2．4 CoQ10通过上调抗凋亡蛋白Bcl-xL，下调促凋亡蛋白BAD的表达抑制细胞凋亡

2．5 CoQ10通过抑制JNK通路，减小细胞毒性

2．6 过表达c-Jun加强CoQ10削弱细胞凋亡

3 讨论

参考文献

全文结论

论文创新点

致谢

攻读学位期间发表和完成的学术论文