赭曲霉毒素A致鸡肝细胞损伤及四种常用护肝药保护机理研究

摘要

赫曲霉毒素A(OTA)是毒性最大、产毒量最高、对农产品污染最重的赫曲霉毒素，它广泛存在于粮食、饲料和粮谷类食物等中。OTA具有肾毒性、肝毒性、致畸性、基因毒性、胚胎毒性等。OTA对家禽的毒性较强，主要引起肝脏损伤，但目前多集中于肝损伤症状报道，机理研究较少。因此，研究OTA致鸡肝细胞损伤病理机制及护肝药物修复效应，具有重要的理论和实践意义。本文藉体外鸡原代肝细胞，研究OTA致鸡肝细胞损伤病理演变及常用护肝药的修复效应及机理。主要研究内容和结果如下:
　　1.OTA诱导鸡原代肝细胞损伤最佳剂量的筛选
　　采用改良的二步Ⅳ型胶原酶循环灌流法，对40-50日龄海蓝公鸡进行肝细胞的分离培养，待培养24 h后，细胞贴壁。在贴壁细胞中分别加入0（对照组）、0.25、0.5、1、2、4μg/mL OTA(n=3)，继续培养24 h。培养结束后，光学显微镜观察细胞形态，取肝细胞培养上清液，检测其中ALT、AST的含量，MTT法测定细胞存活率。结果显示:对照组细胞贴壁牢固，呈多角形，核圆透亮，细胞聚集成岛屿状生长，排列整齐。试验组细胞随着OTA浓度的增大，细胞数量逐渐减少，密度下降，部分肝细胞破裂、坏死悬浮于培养基中，剩余细胞结构松散破碎。细胞存活率和ALT、AST的含量呈剂量依赖性的下降和上升。当细胞中加入1μg/mL OTA培养24 h后，肝细胞存活率为51.33±4.27％,细胞上清液中ALT含量极显著升高，AST含量显著升高。当OTA为2、4μg/mL时，细胞上清液中ALT、AST含量均极显著升高，细胞存活率较低;而0.25μg/mL OTA组，与对照组相比，ALT、AST的含量均无显著性差异。故选择OTA浓度1μg/mL作为致鸡肝细胞损伤的最佳剂量。
　　2.OTA对鸡原代肝细胞氧化应激损伤及凋亡的研究
　　取正常培养24 h的细胞，OTA组中更换含有1μg/mL OTA的培养基(n=3)，继续培养24 h后，收集细胞。检测各组细胞中SOD的活性、GSH和MDA的含量，测定细胞凋亡率及线粒体途径相关基因Caspase-3，Bax，Bcl-2的表达量。结果显示，与对照组相比，1μg/mL OTA可使细胞中SOD的活性和GSH的含量极显著下降，MDA的含量极显著升高，表明OTA可造成肝细胞的氧化应激损伤。通过流式细胞仪检测凋亡率发现，OTA组细胞凋亡率显著增加，可达32.06±2.11％（正常组细胞凋亡率为1.80±0.45％）。OTA组中Caspase-3，Bax表达量极显著上升，Bcl-2表达量显著降低，表明OTA可能是诱导线粒体途径的凋亡。
　　3.复方甘草酸单胺、L-精氨酸、水飞蓟素、葡醛内酯对OTA致肝细胞损伤保护效应
　　3.1复方甘草酸单胺、L-精氨酸、水飞蓟素、葡醛内酯对肝细胞膜的保护作用取正常培养24 h细胞，设置对照组，OTA致损组和四种护肝药物高中低剂量组(0.1、1、10μg/mL)(n=3)。先加入护肝药物预处理，然后加入OTA继续培养24 h后，收集各处理组细胞培养上清液，检测其中ALT、AST含量，MTT法测定细胞存活率，以此研究四种护肝药物对肝细胞膜的保护作用。结果显示，与OTA组相比，复方甘草酸单胺组和葡醛内酯组随药物浓度的增大，细胞存活率升高，ALT的含量下降，呈现剂量依赖性。但复方甘草酸单胺各浓度组细胞培养上清液中AST的含量均无显著变化，但整体呈现下降趋势，葡醛内酯则可使AST显著下降，但各浓度组之间变化趋势无规律可循。L-精氨酸组和水飞蓟素组与OTA组相比，细胞存活率升高明显，ALT含量显著下降，但在低浓度下保护效果较好。水飞蓟素组中AST含量显著下降，但变化无规律，L-精氨酸组则是在1μg/mL浓度下，AST含量下降最明显。此结果表明，复方甘草酸单胺、L-精氨酸、水飞蓟素和葡醛内酯均有保护肝细胞膜的作用。
　　3.2复方甘草酸单胺、L-精氨酸、水飞蓟素、葡醛内酯的抗氧化作用取正常培养24 h细胞，设置对照组，OTA致损组和1μg/mL复方甘草酸单胺组、1μg/mL L-精氨酸组、1μg/mL水飞蓟素组、1μg/mL葡醛内酯组(n=3)。预先加入护肝药物处理，再加入1μg/mL OTA继续培养24 h后，收集各组细胞，检测细胞中SOD活性和GSH、MDA的含量。结果显示，与OTA组相比，四种护肝药物组均可升高SOD活性和GSH含量，降低细胞中MDA含量，其中尤以水飞蓟素作用效果最好，此可表明四种护肝药物均可通过抗氧化作用来抑制OTA导致的肝损伤。
　　3.3复方甘草酸单胺、L-精氨酸、水飞蓟素、葡醛内酯对肝细胞凋亡的影响流式细胞仪检测对照组，OTA致损组和1μg/mL复方甘草酸单胺组、1μg/mL L-精氨酸组、1μg/mL水飞蓟素组、1μg/mL葡醛内酯组(n=3)中细胞的凋亡率，荧光定量PCR检测线粒体凋亡途径相关基因Caspase-3，Bcl-2，Bax的表达。结果显示，与OTA组相比，经四种护肝药物预处理后，细胞凋亡率下降显著，尤以水飞蓟素和复方甘草酸单胺抑制凋亡作用明显。四种护肝药均可在一定程度上降低Caspase-3，升高Bcl-2的表达，但L-精氨酸和葡醛内酯对Bax的表达量无明显降低作用，表明复方甘草酸单胺和水飞蓟素可能是通过抑制线粒体途径的凋亡来达到保护肝细胞的作用，而L-精氨酸和葡醛内酯则可通过改变Caspase-3和Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡，但具体机制仍需进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略符号

前言

第一章 文献综述

1 赭曲霉毒素A的毒性作用研究进展

1．1 OTA的产生及理化性质

1．2 OTA的毒性作用

2 细胞凋亡与肝损伤研究进展

2．1 细胞凋亡

2．2 肝损伤时细胞凋亡的主要调控基因和蛋白

2．3 细胞凋亡途径研究进展

3 常用护肝药的药理作用研究

3．1 复方甘草酸单胺的药理作用研究

3．2 水飞蓟素的药理作用研究

3．3 精氨酸的药理作用研究

3．4 葡醛内酯的药理作用研究

参考文献

第二章 OTA诱导鸡原代肝细胞损伤最佳剂量的筛选

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 光学显微镜下观察OTA对肝细胞形态的影响

2．2 OTA对肝细胞存活率影响

2．3 OTA对肝细胞培养上清液中ALT和AST水平的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 OTA诱导鸡原代肝细胞损伤以及四种常用护肝药物的保护和抗氧化作用

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 四种护肝药对细胞存活率的影响

2．2 四种护肝药对OTA致肝细胞损伤的保护作用

2．3 OTA致肝细胞氧化应激损伤及四种护肝药抗氧化作用

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 OTA诱导鸡原代肝细胞凋亡以及四种常用护肝药物的修复效应

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 Annexin V-FITC／PI双染法检测细胞凋亡率

2．2 实时荧光定量PCR结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢