长期饲喂高精料日粮对奶山羊肝脏蛋白质表达谱及功能影响的研究

摘要

由于缺乏优质牧草，常给泌乳奶牛饲喂高精料日粮以达到高产奶的目的，然而，长期过度饲喂高精料会引起奶牛瘤胃异常发酵，从而影响奶牛健康，最终降低其泌乳性能。肝脏生理机能是机体重要的保护屏障，乳成分前体物也会经肝脏代谢而进行营养的分配与重分配，从而影响免疫与生产性能。本文以泌乳山羊为动物模型，研究长期采食高精料对瘤胃、血液生理指标及乳品质的影响，并采用2D-MALDI TOF/TOF、western blot和real-time PCR技术研究肝脏蛋白质谱的变化，以揭示高精料日粮对泌乳山羊肝脏免疫与代谢的影响及机制;并通过体外原代细胞培养实验，探索内源性脂多糖LPS和瘤胃代谢产物对肝细胞代谢的影响。
　　1.高精料对奶山羊生产性能的影响
　　选择12只泌乳中期关中奶山羊，随机分成高精料组（精粗比为65∶35）和低精料组（精粗比为35∶65），试验期12周。每周记录奶产量，检测乳品质指标。试验结束时，采集瘤胃液、血液和肝脏组织等样品。pH计检测瘤胃液pH值;气象色谱法检测挥发性脂肪酸含量;显色基质法检测瘤胃液LPS浓度;全自动血液生化分析仪检测血浆中白蛋白、胆固醇、血糖等生理生化指标。
　　结果表明:高精料日粮显著降低奶山羊瘤胃液pH(P＜0.01);升高瘤胃液中丙酸(P＜0.01)、丁酸(P＜0.01)、异丁酸(P＜0.05)、戊酸(P＜0.01)、异戊酸(P＜0.01)以及总挥发性脂肪酸VFA(P＜0.05)的浓度;降低乙酸/丙酸的比值(P＜0.01)，显著增加瘤胃液中LPS(P＜0.01)浓度。与低精料日粮相比，高精料日粮显著增加山羊乳产量(P＜0.01)、增加乳糖(P＜0.01)、乳脂(P＜0.01)、乳蛋白(P＜0.01)的含量;增加血液白蛋白(P=0.07)和低密度脂蛋白胆固醇。
　　2.高精料对奶山羊肝脏蛋白表达谱及脂代谢的影响
　　与低精料组相比，高精料组山羊肝体比显著升高(P＜0.05);肝脏CRP mRNA（P＜0.05）、SAA mRNA(P＜0.05)、CD14 mRNA(P＜0.05)表达显著升高，但TNF-αmRNA表达有下降的趋势。用2-DE/MALDI-TOF技术鉴定肝脏蛋白表达谱，共得到20个蛋白点，这些蛋白参与机体氧化应激、线粒体功能以及叶酸代谢等的调节。采用ELLSA方法检测结果表明，与低精料组山羊相比，高精料组山羊肝脏总抗氧化能力显著降低。Real-time PCR检测结果表明，线粒体基因COX3 mRNA表达有上升趋势，ATP8 mRNA表达显著上调。
　　与低精料组山羊比较，高精料组山羊肝脏胆固醇含量显著降低。Real-time PCR结果表明，ABCA1(P＜0.01)、ABCG1(P＜0.01)、LXRα(P＜0.01)、LXRβ(P＜0.05)和SREBP2(P＜0.01)mRNA表达水平显著上升;肝脏ACAA2(P＜0.05)、ACSS1(0.05＜P＜0.1)、FASN(P＜0.05)、PPARα(P＜0.05)、SREBP1c(P＜0.05)、DGAT1(P＜0.05)和DGAT2(P＜0.05) mRNA表达水平均显著上调。
　　3.丁酸钠、LPS对山羊肝细胞糖脂代谢的影响
　　选择2.42 kg、45日龄波杂小山羊，处死后分离肝细胞，贴壁培养4h后，在生长培养基中培养72 h，无血清培养基饥饿细胞24 h。用5mmol/L丁酸钠、100 ng/mL LPS以及5 mmol/L丁酸钠和100 ng/mL LPS共同处理肝细胞24 h，收集细胞上清及细胞。检测细胞活力，上清液中葡萄糖含量;检测细胞中糖脂代谢相关基因表达与蛋白含量的差异。
　　结果显示，丁酸钠显著升高肝细胞活性;丁酸钠处理显著降低上清液中葡萄糖含量。丁酸钠和LPS均显著下调G6Pase mRNA表达，丁酸钠下调PCK2(P＜0.05)、PKLR(P＜0.05)、COX1(P＜0.05)、SCD(P＜0.01)mRNA转录。LPS上调ND4(0.05＜P＜0.1)和PFKL(0.05＜P＜0.1) mRNA表达。蛋白免疫印迹结果表明，丁酸钠处理增加GPR41蛋白表达;丁酸钠处理引起细胞AMPK蛋白表达升高;LPS显著增加肝细胞AMPK和p-AMPK的蛋白含量。
　　以上研究结果表明:长期饲喂高精料的奶山羊在增加乳产量的同时，瘤胃发生酸中毒，肝脏抗氧化能力降低，线粒体氧化磷酸化增强，脂肪酸氧化增强;丁酸钠和LPS处理原代细胞，丁酸钠通过AMPK通路抑制糖异生，LPS通过AMPK通路激活线粒体氧化磷酸化。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 长期饲喂高精料日粮对泌乳反刍动物生理功能的影响

1 内源性异常代谢产物

2 长期饲喂高精料对反刍动物健康的危害

3 氧化应激

第二章 反刍动物肝脏代谢与研究进展

1 LPS对肝脏功能的影响

2 短链脂肪酸对肝脏代谢的影响

3 蛋白质组学技术在肝脏代谢研究中的应用

第三章 高精料日粮对奶山羊泌乳性能和血液生化指标的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 高精料日粮对奶山羊肝脏蛋白表达谱及代谢的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 分析与讨论

第五章 丁酸钠／LPS对山羊肝脏原代细胞AMPK代谢通路下游目的基因的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 分析与讨论

全文总结

本文创新点

参考文献

致谢