应用Padlock探针和LAMP技术检测大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌

摘要

大豆细菌性斑疹和大豆细菌性斑点病是两种重要的大豆种传细菌病害，地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)和丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)分别是这两种细菌性病害的致病菌，是造成大豆减产的重要原因。近年来，这两种病害在国内发病区域和发病面积有逐年扩展之势。由于这两种病害均为种传病害，因此，使用无菌种子是防止病害发生的最有效的措施之一。本研究利用锁式探针技术(Padlock Probe)和环介导等温扩增技术(LAMP)，分别对大豆细菌性斑疹病菌和大豆细菌性斑点病菌建立了快速、灵敏、可靠的检测体系，获得了以下研究成果:
　　首先，本研究分别建立了基于Padlock探针结合正向斑点杂交技术的大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌检测体系。经过大量看家基因序列的比对筛选，最终分别在大豆细菌性斑疹病菌的recF基因和大豆细菌性斑点病菌的rpoN基因设计了Padlock探针PLP-Xag和PLP-Psg。实验结果表明，探针PLP-Xag和PLP-Psg能够特异性识别这两种病菌，且检测灵敏度均为100fg/μL，均高于常规PCR检测方法，从人工模拟带菌的大豆种子中检测出0.1％的种子带菌量。利用该检测体系对市售大豆种子进行实际检测，从45份大豆种子中检出4份带有大豆细菌性斑疹病菌，2份带有大豆细菌性斑点病菌。因此，本研究建立的基于Padlock探针技术的检测体系适用于大豆种子的健康检测。
　　其次，本研究分别建立了基于LAMP技术的大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌检测体系。经过文献参考以及大量看家基因序列的比对筛选，最终分别在大豆细菌性斑疹病菌的glyR基因和大豆细菌性斑点病菌的rpoN基因设计了引物LAMP-Xag和LAMP-Psg，引物均在65℃条件下温育60min，并应用核酸荧光染料SYBR GreenⅠ实现LAMP的可视化检测。实验结果表明，引物LAMP-Xag和LAMP-Psg能够特异性识别这两种病菌，对两种病菌的检测灵敏度分别达到10fg/μL和1pg/μL，均高于常规PCR检测方法，从人工模拟带菌的大豆种子中检测出0.1％的种子带菌量。利用该检测体系对市售大豆种子进行实际检测，从45份大豆种子中检出4份带有大豆细菌性斑疹病菌，2份带有大豆细菌性斑点病菌。因此，本研究建立的基于LAMP技术的检测体系适用于大豆种子的健康检测。
　　综上所述，Padlock探针结合正向斑点杂交技术的检测方法和基于LAMP技术的检测体系均能够满足对大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌的检测要求，为研究大豆其他致病菌的检测系统提供了新的研究数据。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 大豆细菌性斑疹病和斑点病研究现状

1 大豆细菌性斑疹病(Bacterial pustule)

2 大豆细菌性斑点病(Bacterial Blight of Soybean)

3 大豆细菌性斑疹病和斑点病的防治

第二章 植物病原菌的检测和鉴定技术

1 传统检测技术

2 血清学检测技术

3 分子生物学检测法

第二部分 研究内容

第一章 应用Padlock探针技术检测大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第二章 应用LAMP技术检测大豆细菌性斑疹病菌和斑点病菌

1 材料和方法

2 结果与分析

3 结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢