农杆菌介导的大豆子叶节法体系优化及大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

摘要

大豆遗传转化是研究基因功能、培育新品种的一个重要手段，目前常采用农杆菌介导的子叶节转化法来将外源基因导入大豆品种内，该方法具有拷贝数目低、遗传稳定性较高等优点，但同时也具有基因型依赖性强、伸长率低、筛选困难、褐化现象严重、周期长等缺点。Baby Boom(BBM)是一个胚胎发生相关的基因，可以促进细胞增殖和胚胎发生，在组织培养条件下能促进诱导再生。研究表明在烟草、毛白杨、甜椒等植物中异位表达BBM可以促进转化效率的提高。因此，本研究拟通过在大豆中高表达BnBBM基因以提高大豆的再生率和转化率;此外，对大豆子叶节转化过程中的受体基因型、外植体摆放方式、筛选剂浓度、抗氧化剂AgNO3和抗坏血酸Vc的浓度做了比较实验，希望可以优化该转化体系，提高大豆外植体的再生率和最终的转化效率。
　　农杆菌介导的子叶节转化法体系优化的结果如下:①以天隆一号为受体，获得过表达BnBBM基因（35S启动子）的T0代转基因株系1株，其T0代和T1代检测均为阳性，现已收获666粒T2代种子。关于BnBBM是否可以提高大豆子叶节外植体的再生和转化效率有待今后进一步验证。②通过比较不同基因型共培养阶段的GUS瞬时表达率，明确了天隆一号、Jack紫、大粒黄等为侵染效率高的大豆品种，都高达94％以上。③发现外植体切口向上摆放可以显著提高子叶节GUS基因的表达量，Jack紫品种外植体切口向上时，子叶节点染色深的概率为11.6％，显著大于向下时的6.8％;天隆一号品种向上摆放时的染色深概率为63.4％，也显著大于向下时的44.6％。④筛选剂草丁膦的浓度梯度实验结果发现，草丁膦浓度为7 mg·L-1时综合效果最好。⑤继代培养基中添加不同浓度的Vc或AgNO3实验表明，Vc和AgNO3虽未能明显改善外植体的褐化情况，但却显著地提高了伸长率和转化效率，添加Vc可使伸长率从7.9％提高到30％,添加AgNO3可以使转化效率从3.2％提高到5.5％。
　　WRKY家族参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程，AtWRKY28是植物抵抗病原菌和某些非生物逆境所必需的转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like（Glyma14g03280.1）的生物学功能，本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验，还对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析，并将GmWRKY28-like转入模式植物拟南芥中，研究了该基因异位表达时的表型变化。
　　结果显示:①Gm WRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008 bp，编码335个氨基酸。②GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域，含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine)，不含跨膜结构与信号肽。③进化树分析表明与其它植物中的WRKY28蛋白相比，大豆GmWRKY28-like与菜豆WRKY28的相似性最高。④亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。⑤该基因在根、种子中表达量很低，在真叶、花、及茎尖表达量较高。⑥GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫相关元件，如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等。⑦GmWRKY28-like的表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导，且Gm WRKY28-like在拟南芥中的异位表达显著增强了拟南芥抗高浓度NaCl和甘露醇的能力。因此，我们推测GmWRKY28-like可能参与大豆响应这些非生物胁迫的过程。本研究为进一步验证该基因在耐逆（如干旱）方面的功能提供参考依据。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 文献综述

1 大豆遗传转化研究现状

1．1 基因枪法

1．2 花粉管通道法

1．3 农杆菌介导法

2 体胚发生相关基因的研究进展

2．1 Baby Boom

2．2 Leafy Cotyledon

2．3 AGAMOUS-Like15

2．4 WUSCHEL

3 WRKY基因的研究进展

3．1 WRKY家族基因的研究现状

3．2 WRKY28基因的研究现状

4 论文的主要研究意义和内容

4．1 优化大豆子叶节法的意义

4．2 研究Gm WRKY28-1ike基因的意义

5 研究方案

5．1 大豆子叶节法体系优化

5．2 WRKY28-like基因的克隆与功能鉴定

第二章 农杆菌介导的大豆子叶节法体系的优化

1 实验材料

1．1 受体

1．2 菌株与载体

1．3 试剂

1．4 主要仪器设备和耗材

2 实验方法

2．1 BnBBM基因的转化

2．2 子叶节法的因素优化

3 结果与分析

3．1 BnBBM转化结果

3．2 子叶节法的因素优化

4 讨论

第三章 大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能鉴定

1 实验材料

1．1 植物材料

1．2 菌株与载体

1．3 引物、测序、试剂

1．4 主要仪器设备与耗材

2 基因的克隆及分析

2．1 基因克隆

2．2 生物信息学分析

2．3 亚细胞定位载体构建

2．4 组织表达分析

2．5 胁迫表达分析

3 GmWRKY28-like在拟南芥中的过表达

3．1 植物表达载体构建

3．2 GmWRKY28转化拟南芥

3．3 拟南芥在逆境胁迫下的表型分析

4 结果与分析

4．1 GmWRKY28-like基因的克隆与分析

4．2 GmWRKY28-like基因的表达分析

4．3 转GmWRKY28-like的纯合T3代拟南芥表型分析

5 讨论

第四章 全文总结与讨论

本研究创新之处

参考文献

附录

致谢