大豆对大豆疫霉根腐病抗性基因和QTL的定位

摘要

大豆(Glycine max(L.) Merr.)疫霉根腐病（Phytophthora root rot，PRR）是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann& Gerdemann，P.sojae）引起的一种土传病害。大豆疫霉根腐病能够侵染任何生育时期的大豆植株，给全球大豆生产带来巨大的经济损失。对该病最有效的防止措施是选育和应用抗病品种，抗源筛选和新的抗病基因的发掘是抗病品种选育的基础和关键。
　　本研究鉴定栽培大豆微核心种质对3个大豆疫霉菌株的抗性反应，分析抗性种质在全国的地理分布，发掘抗多个疫霉菌株的种质资源。结合微核心种质抗性鉴定的表型，采用关联定位方法寻找与抗性显著关联的SNP位点。利用F2群体和重组自交家系群体进行遗传分析和连锁定位大豆疫霉根腐病完全抗性Rps基因和部分抗性QTL位点。这些结果将有助于分子标记辅助选择，大豆抗性育种和理解大豆对大豆疫霉病抗性的分子机理。
　　1.大豆微核心种质的大豆疫霉根腐病抗性鉴定
　　本实验采用下胚轴接种法鉴定大豆微核心种质对大豆疫霉菌株Pm2(1b，2，3c，7)、H15(1k，3b，3c，5，6，7)和Pm28(1a,1b，1c，1d，1k，2，3b，3c，5，6，7)的抗性反应。结合前人接种鉴定过的菌株P6497、Pm14、HLJ08-35、P7063、AH、HeN08-17、PNJ1、Pmg、 P7071、Pm31和JS08-12的抗性鉴定结果，分析大豆微核心种质的疫霉根腐病抗性特征和抗性种质的地理分布情况。
　　接种结果表明，大豆疫霉菌株对大豆微核心种质有极强的致病能力。具体而言，供试材料对疫霉菌株Pm14的抗性种质最多，占总体的56.7％;对菌株P7063、AH和HLJ08-17的抗性种质数量次之。对其他的其他疫霉菌株的抗性种质数目都小于总数的25％，强毒性菌株pmg和PNJ1能使80％以上的大豆种质表现出致死反应。同时，大豆微核心种质对疫霉菌株的抗性具有多样性。190份种质对1-11个不同的疫霉菌株具有抗性反应。其中有29.5％的种质能够抗1-2个疫霉菌株，22.8％的种质能够抗3-4个疫霉菌株，24.6％的种质能够抗5-7个疫霉菌株。还有18份种质拥有最广的抗谱，能抗8-11个不同的疫霉菌株。
　　比较抗性种质的地理分布和生态类型，发现拥有最多抗性种质的省份是四川、江苏和湖北。湖北、江苏、福建、四川和山东地区的种质抗谱较广（抗＞5个疫霉菌株）。北方和东北部的大豆种质抗谱较窄（抗＜4个疫霉菌株），南方地区和黄淮海地区的种质抗性丰富且抗性多样化且抗谱较广。
　　大豆核心种质对14个疫霉菌株共产生135种不同的反应类型，通过基因推导预测:有34份种质可能不合有抗性基因，22份种质可能含有Rps7基因，种质ZDD03733可能含有Rps1a+Rps3b或者Rps1c+Rps3b的基因组合。
　　2.关联定位大豆微核心种质中的大豆疫霉根腐病抗性位点
　　利用根据覆盖群体全基因组的1749个single nucleotide polymorphism(SNP)标记信息，分析大豆微核心种质的群体结构和亲缘关系，得到Q矩阵和K矩阵。结合14个大豆疫霉菌株接种224份大豆微核心种质的表型结果，采用简单模型(Naivemodel)、一般线性模型(GLM)以及混合线性模型(MLM)三种统计方法进行关联定位，找到与大豆疫霉根腐病抗性稳定相关的19个SNP，其中9个SNP位点是首次被鉴定到与大豆对大豆疫霉根腐病抗性相关。
　　3.大豆疫霉根腐病完全抗性基因RpsLu4的定位
　　根据大豆品种鲁豆4号对10个大豆疫霉菌株的反应类型，基因推导预测鲁豆4号可能含有新的Rps基因。选择对疫霉菌株Pm28(1a,1b，1c，1d，1k，2，3b，3c，5，6，7)有抗感差异的鲁豆4号(R，resistance)和诱处4号(S，susceptible)配制杂交组合，衍生成F2群体。通过亲本和后代群体的抗性鉴定，明确鲁豆4号对疫霉菌株Pm28的完全抗性是由单显性基因控制的。采用混合集团分离分析方法（Bulked SegregantAnalysis，BSA），利用SSR标记定位抗性位点，将RpsLu4定位在3号染色体（N连锁群）的短臂末端，BARCSOYSSR_03_0246和BARCSOYSSR_03_0305标记之间，遗传距离分别为0.5cM和2.6cM，物理位置4，362，217bp-5，369，472bp之间，约1Mb的区段内。该区域内有8个具有NB-ARC和NBS-LRR结构域的基因，将他们列为候选基因。RpsLu4可能是Rps1位点上的一个新的等位基因或者是与其紧密连锁的抗性基因。
　　4.大豆疫霉根腐病部分抗性QTL的定位
　　利用蒙8206×正阳衍生的重组自交家系群体(NJRIZM6)研究对大豆疫霉菌株P7063(1a,1d，3a,6，7)的部分抗性位点。蒙8206和正阳对菌株P7063不具有完全抗性，并且他们对P7063的部分抗性水平有显著差异。对亲本和126份F2∶8重组自交家系进行根部接种鉴定部分抗性水平，以病斑长度为指标。使用WinQTLCart软件，采用复合区间作图(CIM)，对部分抗性进行QTL定位。在1号和17号染色体检测到2个QTL: qtl-01和qtl-17，他们分别有7.9％和8.7％的表型变异解释率，其抗性等位基因分别来自正阳和蒙8206。qtl-01区域与前人定位的大豆疫霉根腐病、大豆胞囊线虫(SCN)抗性QTL区域重叠，qtl-17与前人鉴定的抗大豆茵核病QTL、抗大豆猝死综合症QTL，以及抗疫霉根腐病QTL区间有重叠，并且十分靠近Rps10基因。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 大豆疫霉根腐病病原菌的研究

1．1 生态学特征和生活史

1．2 病害发生

1．3 病害症状

2 大豆对大豆疫霉菌的抗性研究

2．1 大豆对大豆疫霉菌的抗性类型

2．2 大豆疫霉根腐病抗性鉴定方法

2．3 大豆疫霉菌生理小种与大豆鉴别寄主

2．4 抗源筛选和抗病基因推导

3 大豆对大豆疫霉根腐病抗性基因的发掘

3．1 大豆分子遗传图谱和基因组测序

3．2 遗传作图研究

3．3 完全抗性基因的定位和克隆

3．4 部分抗性QTL位点的定位

4 本研究的目的和意义

第二章 大豆微核心种质对大豆疫霉根腐病的抗性鉴定

1 材料与方法

1．1 大豆微核心种质

1．2 大豆疫霉菌株

1．3 表型鉴定

2 结果与分析

2．1 大豆微核心种质的地理分布

2．2 大豆疫霉菌株的毒力分析

2．3 大豆微核心种质抗性鉴定

2．4 大豆微核心种质抗病基因推导

3 讨论

第三章 关联定位大豆微核心种质中的大豆疫霉根腐病抗性位点

1．4 连锁不平衡

1．5 群体结构和亲缘关系

1．6 关联分析

2 结果与分析

2．1 SNP标记遗传多样性

2．2 连锁不平衡

2．3 群体结构和群体间亲缘关系

2．4 全基因组关联分析抗性关联SNP

3 讨论

3．1 群体的选择

3．2 连锁不平衡

3．3群体结构和群体间亲缘关系

3．4 不同线性模型对关联分析结果的影响

3．4 稳定关联的SNP

第四章 大豆疫霉根腐病完全抗性基因RpsLu4的定位

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 供试菌株

1．3 抗性鉴定方法

1．4 DNA的提取及PCR扩增

1．5 实验所用试剂配方及实验仪器

1．6 抗感池的构建

1．7 连锁遗传分析

2 结果与分析

2．2 抗性遗传分析

2．3 SSR标记筛选

2．4 抗病基因定位

2．5 候选基因预测

3 讨论

第五章 大豆疫霉根腐病部分抗性QTL定位

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 供试菌株

1．3 抗性鉴定方法

1．4 群体分子标记数据

1．5 表型数据分析

2 结果与分析

2．1 亲本和重组自交家系群体(NJRIZM6)的部分抗性鉴定

2．2 对大豆疫霉根腐病部分抗性QTL的定位

2．3 QTL位点序列分析

3 讨论

全文总结

本研究创新之处

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢