山羊PBMC捻转血矛线虫Galectin受体TMEM63A和TMEM147的部分功能研究

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于反刍动物的胃肠道线虫，能够导致感染动物贫血、消瘦甚至死亡。半乳糖结合凝集素(galectin)是一种糖结合蛋白，能够显著调节寄生虫-宿主之间的相互作用。Hco-gal-m和Hco-gal-f是由本实验室分别从捻转血矛线虫的雄虫和雌虫体内克隆得到的半乳糖结合凝集素。研究表明，重组Hco-gal-rm/f(rHco-gal-m/f)能够结合在山羊外周血淋巴细胞(PBMC)表面，诱导山羊PBMC的凋亡，对细胞因子分泌、细胞迁移、细胞增殖和分化等产生影响。这些研究结果提示，rHco-gal-m/f可能作为一种多功能的免疫调节因子参与捻转血矛线虫感染过程中的宿主免疫。TMEM63A和TMEM147是捻转血矛线虫galectin在山羊PBMC中的受体，分布于大多数的山羊外周血淋巴细胞。研究表明，TMEM63A能够影响Hco-gal-m/f对山羊PBMC大部分功能的调节，然而具体的分子机制以及TMEM147在其中的作用还是未知。对TMEM63A和TMEM147的功能研究有利于进一步探索捻转血矛线虫的免疫逃避机制，并为预防和控制捻转血矛线虫病提供了新的思路。
　　1山羊外周血淋巴内TMEM63A结合分子的鉴定
　　本研究的目的是为了鉴定山羊外周血淋巴细胞中能与TMEM63A结合的分子。首先通过免疫共沉淀技术收集山羊外周血淋巴细胞中与TMEM63A结合的分子，用鸟枪法——液相色谱质谱/质谱联用(shotgun LC-MS/MS)进行蛋白的质谱鉴定。结果显示，共有43种蛋白被鉴定，包括antigen processing and presentation通路中的MHC classⅠantigen(MHCⅠ)，toll-like receptor signaling pathway通路中的toll-like receptor9(TLR-9)，hedgehog signaling pathway通路中的Gli3 protein(Gli3)，VEGF signalingpathway通路中的heat shock27 kDa protein1(HSP27)，p53 signaling pathway通路中的Bcl-2-associated X protein(BAX)以及Notch signaling pathway通路中的Deltex-2protein(DTX2)。这些蛋白可能参与到Hco-gal-m/f对山羊外周血淋巴细胞的功能调节中，为更好地理解Hco-gal-m/f介导的免疫调节的分子机制提供了新的线索。
　　2 TMEM63A对PBMC相关信号通路的影响
　　根据KEGG数据库，选取了6条信号通路中的45个关键分子。应用实时定量PCR的方法对TMEM63A干扰前后的山羊PBMC进行相关信号通路分析。结果表明，TMEM63A的干扰对Gli3和DTX2的mRNA转录水平没有显著影响，然而MHCⅠ、TLR-9、HSP27、BAX及其所在信号通路关键分子的mRNA转录水平却在TMEM63A干扰后发生显著变化。对TMEM63A相关信号通路的研究为探寻TMEM63A的作用靶位点和研究Hco-gal-m/f的免疫调节机制提供了新的线索。
　　3 TMEM147在Hco-Gal-m/f调节山羊PBMC功能中的作用
　　实验室前期研究发现，TMEM147在酵母双杂交中也能够与捻转血矛线虫galectin结合。为了探索TMEM147和TMEM63A在Hco-gal-m/f调节山羊PBMC功能中的不同影响，本文通过RNA干扰技术对TMEM147的功能进行了初步研究。在体外干扰48小时之后，加入rHco-gal-m共孵育12小时，然后对山羊外周血淋巴细胞的增殖、NO分泌、吞噬、迁移和凋亡进行检测。分析结果表明，TMEM147的干扰能够显著影响Hco-gal-m/f对山羊PBMC的细胞增殖、NO分泌、细胞吞噬和细胞凋亡的调节作用，而对细胞迁移的作用不显著。对Hco-gal-m/f受体TMEM147的功能研究有助于进一步阐明Hco-gal-m/f介导的免疫调节机制，为探寻捻转血矛线虫免疫逃避的分子机制提供了新的线索。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病

1 病原学

1．1 虫体形态特征

1．2 生活史

2 捻转血矛线虫病

2．1 流行病学

2．2 致病作用和症状

2．3 诊断与防治

3 捻转血矛线虫是重要的模式寄生虫

参考文献

第二章 半乳糖结合凝集素

1 Galectins的结构和分类

2 Galectins的分泌和分布

3 Galectins的功能

3．1 Galectins在免疫调节中的作用

3．2 Galectins在先天性免疫中的作用

3．3 Galectins与细胞凋亡

3．4 Galectins与免疫细胞的激活和分化

3．5 Galectins对Th1／Th2细胞因子的调节作用

4 蠕虫Galectins研究进展

5 Galectins结合蛋白的研究进展

参考文献

第三章 山羊外周血淋巴细胞内TMEM63A结合分子的鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 TMEM63A对PBMC相关信号通路的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据处理

2 结果

2．1 Antigen processing and presentation通路关键基因的实时定量PCR分析

2．2 Toll-like receptor signaling pathway 通路关键基因的实时定量PCR分析

2．3 Hedgehog signaling pathway通路关键基因的实时定量PCR分析

2．4 VEGF signaling pathway通路关键基因的实时定量PCR分析

2．5 P53 signaling pathway通路关键基因的实时定量PCR分析

2．6 Notch signaling pathway通路关键基因的实时定量PCR分析

3 讨论

参考文献

第五章 TMEM147在Hco-gal-m／f调节山羊PBMC功能中的作用

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．2 rHco-gal-m与TMEM147的结合对单核细胞吞噬功能的影响

2．3 rHco-gal-m与TMEM147的结合对山羊PBMC一氧化氮分泌水平的影响

2．4 rHco-gal-m与TMEM147的结合对山羊PBMC迁移能力的影响

2．5 rHco-gal-m与TMEM147的结合对山羊PBMC凋亡的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢