芝麻受青枯菌诱导前后的转录组测序分析及水通道蛋白家族基因的鉴定

摘要

芝麻(Sesamum indicum)是重要的油料作物，其营养价值已经得到广泛的认可和应用。芝麻青枯病是影响我国南方芝麻产量及质量的重要病害，由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，属细菌病害。植物青枯病广泛分布于温带、热带和亚热带地区，致病菌株在世界范围肉传播扩散，已成为第二大植物细菌病原。由于青枯病的土传特性，使得该病的防治非常困难，迄今为止尚无有效的防治方法。目前，芝麻中还未发现高抗青枯病的种质资源，开展芝麻-青枯雷尔氏菌互作机制的研究，阐明病菌致病以及植物感病的机理有助于探索新的抗病育种策略。
　　本试验选取了芝麻受青枯菌诱导前后的三个不同时期，利用第二代高通量测序仪Illumina HiSeq2500对其进行转录组测序，且每个时期做了两个生物学重复。共获得了13.5Gb的数据，平均每个样本2.25Gb。生物学重复间的相关性均较好，这表明此次试验的测序数据是可重复及可靠的。原始数据质控后用TopHat2回贴到中国农业科学院油料作物研究所已经公布的芝麻基因组上，利用Cufflinks软件根据回贴情况进行表达定量和差异表达等分析。共得到了4367个差异基因，各比较组中下调基因均多于上调基因，S0 vs S1比S1 vs S2中差异基因数目多一倍多，表明发病初期芝麻茎部差异表达的基因明显多于发病中期，初期转录组的变化更为显著，可能是青枯菌侵染芝麻使其致病的关键性时期。通过对差异表达基因的聚类分析将所有差异基因分成了6个聚类群，不同聚类群的基因数目不一。在聚类分析的基础上通过agriGO对聚类群分开进行了GO富集分析，发现差异基因主要富集在碳水化合物代谢、催化结合、脂质代谢和初级代谢等方面。不同聚类群之间富集到的功能有交叉也有不同，具有相似表达模式的聚类群聚集到的功能也相似。Pathway富集分析结果显示，淀粉和蔗糖代谢和碳代谢在各个聚类群中均有相当数量的基因分布，C2和C5中聚集到的代谢途径主要有植物激素信号转导、植物病原菌的相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、过氧化物酶体和氨基酸生物合成。其中植物病原菌的相互作用在C1和C6中也有显著的富集，即包含上调表达基因又包含下调表达的基因。氨基糖和核苷酸糖代谢主要分布于C1和C4中，表明氨基糖和核苷酸糖代谢受青枯菌诱导后在芝麻茎部受到抑制。
　　通过生物信息学手段，结合芝麻基因组注释信息，鉴定了36个芝麻AQP家族基因，根据多序列比对及系统进化分析将其分为5个亚家族:13个质膜内在蛋白(PIP)、12个液胞膜内在蛋白(TIP)、8个类NOD26膜内在蛋白(NIP)、2个膜内在小分子碱性蛋白(SIP)和1个未知内在蛋白(XIP)，其中有34个基因定位在12个连锁群上。同一亚家族成员在基因结构、蛋白序列、亚细胞定位预测及保守性氨基酸残基等方面都较为相似。病菌诱导表达分析显示，NIPs、SIPs和XIPs表达无明显变化，部分PIPs和TIPs能够响应青枯雷尔氏菌诱导。例如，SiPIP1;2、SiPIP1;3、SiPIP2;3和SiPIP2;4受青枯菌诱导后表达上调，SiPIP1;3和SiPIP2;3为持续上调,而SiPIP1;2和SiPIP2;4的表达先下调后上调;与之相反，表达下调较为显著的有SiPIP1;4、SiPIP2;1、SiPIP2;6、SiTIP1;1、SiTIP1;3、SiTIP2;1及SiTIP2;2。上进差异表达基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。根据ar/R滤器和P1-P5氨基酸残基的组成类型，我们预测了不同亚家族AQPs可能识别的底物。青枯菌诱导表达分析表明，部分PIPs和TIPs成员的表达发生了显著变化，可能在芝麻与青枯菌互作过程中发挥重要的作用。

目录

声明

摘要

第一章 芝麻青枯病及其致病菌相关研究进展

1 青枯病及其致病菌

1．1 青枯菌形态特征与分类

1．2 寄主和分布

1．3 青枯菌的存活、侵染和致病

2 芝麻青枯病

2．1 芝麻青枯病的发生与危害

2．2 芝麻青枯病的防控技术

3 青枯病抗病相关研究进展

3．1 Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白

3．2 植物感病和抗病的复杂机制

第二章 转录组测序技术及其应用

1 转录组学研究进展

2 转录组测序技术

2．1 测序技术的发展

2．2 转录组测序技术优势

2．3 转录组测序技术的应用

第三章 植物水通道蛋白研究进展

1 植物水通道蛋白的分类和命名

2．1 植物水通道蛋白结构

2．2 植物水通道蛋白跨膜转运的底物特异性

3 植物水通道蛋白的功能

3．1 生理功能

3．2 非生物胁迫

3．3 生物胁迫

第四章 芝麻受青枯菌诱导前后转录组测序分析及水通道蛋白家族基因的鉴定

1．1 供试材料

1．2 青枯雷尔氏菌接种芝麻

1．3 转录组测序分析

1．4 芝麻水通道蛋白家族序列鉴定与分析

2 结果与分析

2．1 芝麻总RNA提取和文库构建

2．2 测序质量评估和参考基因组拼接

2．3 差异表达基因的筛选

2．4 差异表达基因的分析

2．5 差异表达基因的定量验证

2．6 芝麻AQP家族的成员鉴定与系统进化分析

2．7 连锁群分布与基因结构分析

2．8 蛋白特征与保守性氨基酸残基的分析

2．9 芝麻水通道蛋白的表达分析

3 讨论

3．1 转录组测序分析

3．2 水通道蛋白家族的分析

全文总结

参考文献

已发表的论文

致谢