SARA状态下瘤胃产生的LPS对反刍动物乳腺炎症反应和酪蛋白合成的影响及其调控

摘要

奶业是我国畜牧业的重要组成部分，牛奶质量安全问题严重制约我国奶业的健康发展。乳蛋白和乳脂肪是构成牛奶营养品质的主要物质基础，既涉及质量安全与消费者的健康，又决定着牛奶的经济价值与核心竞争力。在现代畜牧业生产中，为了提高奶产量，同时满足泌乳早期和中期不断增加的能量需求，奶牛或奶山羊需要饲喂高精料日粮，这种饲喂方式会引起瘤胃异常发酵，进而引起亚急性瘤胃酸中毒。瘤胃内LPS蓄积并透过胃肠道进入全身循环系统到达乳腺，到达乳腺的LPS可激活NF-κ B信号通路，抑制mTOR信号通路，导致乳腺炎症反应以及乳蛋白合成功能的抑制。面对我国现有粗饲料品质差的现实，如何在目前饲养模式下，既提高动物生产性能，又能维持动物健康，已成为当前高强度饲养中急需解决的问题。丁酸钠有促进胃肠道组织发育和增强其屏障功能的作用，能够抑制LPS介导的NF-κ B信号通路，阻止促炎性细胞因子的释放，一定程度的治疗乳腺的炎症反应，恢复乳腺酪蛋白的合成功能。本试验还从外源灌注和体外细胞实验进一步验证了LPS对乳腺组织天然免疫反应和酪蛋白合成功能的影响。
　　1.消化道产生的LPS对奶牛乳腺免疫功能和乳蛋白合成功能的影响
　　为了满足泌乳的营养需求，奶牛通常饲喂高精料日粮。但是高精料饲喂会引起亚急性瘤胃酸中毒（SARA），导致乳蛋白下降。本研究旨在探明饲喂高精料日粮的奶牛瘤胃中产生的脂多糖(LPS)对乳腺炎性基因表达和酪蛋白合成的影响。12头体重为455±28kg的泌乳中期荷斯坦奶牛随机分为两组:一组饲喂高精料日粮（含60％的精料和40％粗料，HC）;一组饲喂低精料日粮（含40％的精料和60％粗料，LC），饲喂周期为18周。高精料日粮饲喂后瘤胃PH值小于5.6每天超过3小时，说明高精料日粮成功诱发了SARA。我们发现在高精料日粮饲喂15周以后，乳蛋白显著下降，体细胞数显著升高，且瘤胃液和乳腺动静脉血浆中的LPS含量显著升高。乳腺血浆中的促炎性细胞因子IL-1B、IL-6和TNF-α含量显著升高。通过乳腺组织转录组芯片技术的分析，发现与炎症相关的信号通路的表达被激活了，而与酪蛋白合成相关的信号通路表达受到抑制。同时，高精料组炎症基因如LBP、TLR4、NF-κB、IL-1B和IL-6等的mRNA表达上调，而αs1酪蛋白和β酪蛋白及其合成相关基因mTOR、S6K等的表达下调。本试验还检测了相关信号通路上的关键蛋白表达，发现其表达与基因的mRNA表达一致，说明了饲喂高精料后，乳腺TLR4介导的炎症信号通路被激活，酪蛋白合成相关的mTOR信号通路受到抑制。因此，泌乳奶牛饲喂高精料日粮后，瘤胃产生的LPS增强了乳腺的炎症基因的表达，抑制了乳蛋白的合成。
　　2.丁酸钠对高精料日粮模式下奶山羊乳腺免疫功能和酪蛋白合成功能的影响
　　本试验采用18头体重为38.86±2.06 kg泌乳中期的萨能奶山羊，随机分为三组，每组6只。三组的饲喂方案如下:第一组饲喂低精料日粮，即日粮中含有40％的精料和60％的粗料，精粗比为4∶6，LC组;第二组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，HC组;第三组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，并且在日粮中添加丁酸钠，BHC组。饲喂周期为20周，试验开始前为所有奶山羊安装瘤胃瘘管和乳腺动静脉血管插管，试验后期采集瘤胃液、奶、乳腺动静脉血和乳腺组织样品。高精料日粮引起了瘤胃pH的下降，诱导了SARA的产生。高精料日粮中添加丁酸钠后瘤胃pH值有一定回升;HC组外周血中LPS的含量显著高于LC组和BHC组(p＜0.01);HC组外周血中的促炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量都显著高于LC组和BHC组(p＜0.05);丁酸钠组奶山羊乳腺炎症基因LBP、TLR4、NF-κB、IL-1B和IL-6等表达目比于高精料组显著下调(p＜0.05)，乳蛋白合成相关基因CSN2、mTOR和S6K等表达显著上调(p＜0.05)。相关基因的蛋白表达的水平和mRNA水平是一致的，说明丁酸钠可以抑制LPS介导的TLR4炎症信号通路，缓解乳蛋白的合成抑制。因此，高精料日粮中添加丁酸钠可以一定程度上治疗高精料日粮诱导的SARA状态下的奶山羊乳腺炎症反应，恢复酪蛋白合成功能。
　　3.肠系膜静脉灌注LPS对奶山羊乳腺天然免疫功能和泌乳功能的影响
　　8只分娩3周以内、体重在42±2.8 kg萨能奶山羊，分栏饲喂。试验中根据泌奶山羊饲养标准设计相同的日粮，所有试验动物均安装肠系膜血管插管。试验动物被随机分为两组，一组肠系膜灌注LPS作为处理组(Treatment);一组肠系膜灌注生理盐水为对照组(Control)。灌注后4h采集血样，处死后采集乳腺组织样品。肠系膜灌注LPS的奶山羊血液中的LPS含量远远高于灌注生理盐水的。LPS灌注组的奶山羊乳腺炎症基因LBP、TLR4、NF-κB、IL-1B和IL-6等表达远高于对照组，且乳蛋白合成相关基因CSN2、mTOR，S6K、JAK2和STAT5等表达表达下调。乳腺中TLR4启动子区域染色质处于开放状态，DNA去甲基化，导致TLR4基因表达增强;CSN2启动子区域的染色质处于压缩状态，DNA甲基化率升高，导致CSN2基因表达下调。本研究表明，肠系膜灌注LPS上调了乳腺炎性基因的表达，抑制的酪蛋白合成相关基因的表达，并从一定程度上通过表观遗传学机制调控TLR4和CSN2基因的表达，对乳腺的炎症反应和酪蛋白合成功能造成影响。
　　4.LPS在MAC-T细胞上通过NF-κB信号通路调节炎症基因的表达
　　本试验以乳腺上皮细胞传代细胞系MAC-T细胞为研究对象，分别作5种处理:PBS组;添加100ng/mL LPS组;NF-κB过表达组;LPS+BAY11-7085组和LPS+MG132组。本试验发现LPS浓度在0.1-1000 ng/mL之间时，TLR4表达随着浓度的升高的增加，LPS浓度大于1000 ng/mL后，TLR4表达变化不大。最后我们选择了100 ng/mL的LPS浓度作为处理浓度。只有当LPS浓度很高时才会导致MAC-T细胞凋亡，因此其凋亡的生物学意义较小。LPS处理的MAC-T细胞内NF-κ B表达上调，且促炎性因子的表达也增加了。NF-κB的过表达上调了细胞的炎症基因蛋白的表达。NF-κB的两种抑制剂BAY11-7085和MG132都抑制了NF-κB蛋白的表达。BAY11-7085抑制了炎性基因的表达，特别是IL-1B; MG132同样也抑制了这些基因的表达，尤其是IL-8。因此，我们认为，NF-κ B在LPS激活的TLR4炎症信号通路上具有重要的作用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 反刍动物瘤胃亚急性酸中毒和脂多糖

1 SARA的产生机制

2 SARA的发病率、影响和治疗

2．1 干物质采食量下降

2．2 乳成分变化

2．3 系统性疾病

2．4 瘤胃微生物和细菌免疫原

2．5 SARA的治疗和预防

3 SARA状态下LPS引起的天然免疫反应

3．1 SARA状态下LPS的产生及转移机制

3．2 SARA状态下LPS引起的免疫反应

3．3 SARA状态下LPS对代谢的影响

参考文献

第二章 LPS对乳腺天然免疫和泌乳功能的影响

1 LPS的结构与理化性质

1．1 LPS的主要结构

1．2 LPS的理化性质

2 LPS相关的天然免疫信号通路

2．1 LPS的识别受体

2．2 TLRs相关的信号通路

3 LPS对乳蛋白合成的影响

3．1 乳蛋白合成的相关信号通路

3．2 LPS对乳腺泌乳功能的影响

参考文献

第三章 丁酸钠对LPS引起的天然免疫反应的影响

1 丁酸钠的主要作用

1．1 丁酸的理化性质和吸收代谢

1．2 丁酸的生物学效应

2 丁酸钠与表观遗传学机制

2．1 表观遗传学机制与炎症

2．2 丁酸钠抗炎的表观遗传学机制

参考文献

第四章 消化道产生的LPS对奶牛乳腺免疫功能和乳蛋白合成功能的影响

1 材料和方法

1．1 主要仪器与试剂

1．2 试验动物和试验设计

1．3 样品采集

1．4 样品检测

1．5 RNA提取与定量

1．6 转录组芯片的信号通路分析

1．7 蛋白提取与定量

1．8 统计

2 结果与分析

2．1 瘤胃pH值，瘤胃液和血浆中的LPS，血浆中的细胞因子

2．2 乳蛋白和体细胞数变化规律

2．3 转录组芯片技术及信号通路分析

2．4 免疫相关基因在乳腺中的表达

2．5 酪蛋白及其合成相关基因在乳腺中的表达

2．6 免疫相关基因的蛋白在乳腺中的表达

2．7 酪蛋白相关基因的蛋白在乳腺中的表达

3 讨论

4 小结

参考文献

第五章 丁酸钠对高精料日粮模式下奶山羊乳腺免疫功能和酪蛋白合成功能的影响

1 材料和方法

1．1 主要仪器与试剂

1．2 试验动物和试验设计

1．3 样品采集

1．4 样品检测

1．5 RNA的提取、反转与定量

1．6 总蛋白的提取与定量

1．7 数据统计

2 结果与分析

2．1 丁酸钠对奶山羊瘤胃液pH值的影响

2．2 丁酸钠对奶山羊奶产量和乳成分的影响

2．3 丁酸钠对奶山羊外周血中LPS含量的影响

2．4 丁酸钠对奶山羊外周血中炎性因子含量的影响

2．5 丁酸钠对奶山羊乳腺组织中炎性基因的表达

2．6 丁酸钠对奶山羊乳腺组织中酪蛋白合成相关基因的表达

2．7 丁酸钠对奶山羊乳腺组织中炎性基因蛋白的表达

2．8 丁酸钠对奶山羊乳腺组织中β-casein蛋白的表达

3 讨论

4 小结

参考文献

第六章 肠系膜静脉灌注LPS对奶山羊乳腺天然免疫功能和泌乳功能的影响

1 材料和方法

1．1 主要仪器与试剂

1．2 试验动物和试验设计

1．3 肠系膜静脉插管手术

1．4 样品采集

1．5 样品检测

1．6 RNA的提取、反转与定量

1．7 染色质提取和CHART-PCR

1．8 基因组DNA的提取以及甲基化状态的检测

1．9 数据统计

2 结果与分析

2．1 肠系膜灌注LPS对奶山羊乳腺动静脉中LPS含量的影响

2．2 肠系膜灌注LPS对奶山羊乳腺炎症基因表达的影响

2．3 肠系膜灌注LPS对奶山羊乳腺蛋白合成相关基因表达的影响

2．4 肠系膜灌注LPS对乳腺中TLR4启动子区域染色质结构和DNA甲基化的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

第七章 LPS在MAC-T细胞上通过NF-κB信号通路调节炎症基因的表达

1 材料和方法

1．1 主要仪器与试剂

1．2 试验设计

1．3 细胞培养

1．4 RNA的提取、反转与定量

1．5 总蛋白的提取与定量

1．6 流式细胞仪检测细胞凋亡

1．7 质粒构建和细胞转染

2 结果与分析

2．1 LPS浓度对TLR4表达的影响

2．2 LPS浓度对细胞凋亡的影响

2．3 NF-κB过表达和NF-κB抑制剂对MAC-T细胞炎性基因表达的影响

2．4 NF-κB过表达和NF-κB抑制剂对MAC-T细胞NF-κB蛋白表达的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

本论文创新点

攻读学位期间发表的学术论文

致谢