产GSH富硒益生菌对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的保护作用及机理研究

摘要

肝脏是机体物质代谢的主要器官，其在维持机体稳态和免疫方面发挥着不可替代的作用。但随着环境污染的日益严重，生活方式的改变及药物的滥用，人和宠物的慢性肝病的发病率越来越高，肝脏疾病严重地威胁着人和宠物的健康。肝纤维化是由多种致病因子诱发的一种慢性肝脏疾病，其是肝硬化和肝癌的病理基础。因此，预防和治疗肝纤维化是人和宠物肝病治疗的关键。目前，在对人和宠物肝纤维化的防治方面，突破性的研究较少。因此，研究和开发具有抗肝纤维化的药物或试剂是急需的。近年来，一些用于预防和治疗肝纤维化的食源性的产品吸引了人们的广泛关注。有机硒，还原型谷胱甘肽(GSH)和益生菌在人和宠物肝病的防治方面起着非常重要的作用。它们均已被证明可有效地改善人和宠物肝脏的纤维化。
　　本研究首先从蜂蜜中分离并鉴定得到一株高产GSH的酿酒酵母菌。通过培养基和发酵条件的优化，进一步提高细胞内GSH的产量。然后，以此高产GSH的酵母菌和嗜酸乳杆菌为菌种，将其接种于含亚硒酸钠的培养基中。最终，得到一种新型的生物制品—产GSH富硒益生菌，该生物制品具有机硒，GSH和益生菌等的多重生物作用。然后，我们用本实验室自主研发的富硒益生菌饲喂四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠，发现其可有效改善大鼠的肝纤维化。以此为研究基础，我们将产GSH富硒益生菌灌胃CCl4诱导的肝纤维化大鼠，观察其对肝纤维化大鼠的保护作用并阐述其中的相关机理。为产GSH富硒益生菌在人或宠物肝病防治领域的推广应用提供理论依据和数据支持。
　　试验1一株高产GSH酵母菌的分离鉴定
　　本试验从蜂蜜中分离鉴定了一株高产GSH的酿酒酵母菌。根据菌落形态和细胞形态特征从蜂蜜中分离得到6株酵母菌，并记录了其繁殖方式。用摇瓶进行产GSH发酵实验，结果发现C菌株胞内GSH产量显著高于其他菌株。然后，结合26S rDNA D1/D2区序列分析，鉴定该菌株为酿酒酵母菌，命名为NAU-LYH-S GS。对其进行产GSH发酵试验，该菌株胞内GSH产量为92.6mg/L，活菌数量为2.5×107 CFU/mL。
　　试验2产GSH富硒益生菌的研制
　　本试验成功研制了一种新型的生物制品—产GSH富硒益生菌。首先，采用单因素法在摇瓶中对产GSH富硒益生菌的培养基和发酵条件（酵母菌接种量和发酵时间）进行优化，优化后的发酵培养基组成为:葡萄糖2％、酵母浸膏3％、玉米浆干粉0.8％、L-半胱氨酸0.06％;发酵条件为:酵母菌接种量为10％，发酵时间为72h。然后，采用响应面法在发酵罐中对产GSH富硒益生菌的发酵条件（温度，pH和溶氧）进行优化，优化后的发酵条件为:温度30℃、pH6.0、溶氧85％。最后，采用单因素法在发酵罐中对产GSH富硒益生菌中嗜酸乳杆菌接种量和Na2SeO3的添加量进行优化，优化后的嗜酸乳杆菌接种量为2％，Na2SeO3的添加量为0.6 mg/L。最终，产GSH富硒益生菌胞内GSH含量为480.3mg/L，有机硒含量为38.4μg/g，酵母菌和嗜酸乳杆菌活菌数分别约为1×1010CFU/g和1×1012 CFU/g。
　　试验3不同剂量的产GSH富硒益生菌对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的影响
　　40只雄性大鼠均分5组每组8只。(A)对照组(Control)，(B)四氯化碳模型组(CCl4)，(C)四氯化碳+低剂量产GSH富硒益生菌组(CCl4+LSGP)，(D)四氯化碳+中剂量产GSH富硒益生菌组(CCl4+MSGP)，(E)四氯化碳+高剂量产GSH富硒益生菌组(CCl4+HSGP)。(A)组腹腔注射橄榄油（2ml/kg体重），1周两次共8周。(B-E)组中大鼠腹腔注射CCl4(2 ml/kg体重，CCl4:橄榄油为1∶1)，1周两次共8周。(C-E)组中大鼠每天分别灌胃低剂量的产GSH富硒益生菌(0.5 g/kg体重)，中剂量产GSH富硒益生菌（1 g/kg体重），高剂量产GSH富硒益生菌(1.5 g/kg体重)，持续8周。将产GSH富硒益生菌溶于生理盐水后每天给大鼠灌胃。其中，(C-E)组中大鼠每天GSH摄入量分别为17.0，34.1和51.1 mg/kg体重。(C-E)组中大鼠每天有机硒摄入量分别为19.2，38.4和57.6μg/kg体重。(C-E)组中大鼠每天摄入的酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌活菌数分别约为1×1010 CFU和1×1012 CFU。实验结果表明，不同剂量的SGP均可改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。中剂量和高剂量的SGP对的CCl4诱导的大鼠肝纤维化的保护作用比低剂量的SGP要好。但中剂量SGP和高剂量SGP相比，这种肝脏的保护作用并没有显著差异。因此，我们选择中剂量的SGP进行下一步试验。
　　试验4三种益生菌对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的影响的比较
　　40只雄性大鼠均分5组每组8只。(A)对照组(Control)，(B)四氯化碳模型组(CCl4)，(C)四氯化碳+富硒益生菌组(CCl4+SP)，(D)四氯化碳+产GSH益生菌组(CCl4+GP)，(E)四氯化碳+中剂量产GSH富硒益生菌组(CCl4+MSGP)。(A)组腹腔注射橄榄油（2ml/kg体重），1周两次共8周。(B-E)组中大鼠腹腔注射CCl4（2 ml/kg体重，CCl4∶橄榄油为1∶1），1周两次共8周。(C-E)组中大鼠每天分别灌胃富硒益生菌(1.1 g/kg体重)，产GSH益生菌(1.1 g/kg体重)，中剂量产GSH富硒益生菌(1.5 g/kg体重)，持续8周。将此三种益生菌分别溶于生理盐水后每天给大鼠灌胃。其中，D和E组中大鼠每天GSH摄入量为34.1 mg/kg体重。C和E组中大鼠每天有机硒摄入量为38.4 g/kg体重。(C-E)组中大鼠每天摄入的酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌活菌数分别约为1×1010 CFU和1×1012 CFU。试验结果表明，SP，GP和SGP均可改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。但SGP对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的改善作用较SP或GP更好。SGP中的GSH，有机硒和益生菌在对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的保护作用均发挥了重要的作用。这种保护作用的主要机理为:SGP可通过降低肝内氧化应激水平，炎症，MAPK信号通路的激活和内质网应激水平来改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。
　　试验5产GSH富硒益生菌通过激活SIRT1信号通路来降低CCl4诱导的大鼠肝纤维化
　　40只雄性大鼠均分5组每组8只。(A)对照组(Control)，(B)四氯化碳模型组(CCl4)，(C)四氯化碳+中剂量产GSH富硒益生菌组(CCl4+MSGP)，(D)四氯化碳+ EX527组(CCl4+EX527)，(E)四氯化碳+中剂量产GSH富硒益生菌+ EX527组(CCl4+MSGP+EX527)。(A)组腹腔注射橄榄油(2 ml/kg体重)，1周两次共8周。(B-E)组中大鼠腹腔注射CCl4(2 ml/kg体重，CCl4∶橄榄油为1∶1)，1周两次共8周。D组和E组中大鼠每天腹腔注射EX527（2 ml/kg体重），持续8周。C组和E组中大鼠每天灌胃中剂量产GSH富硒益生菌(1 g/kg体重)，持续8周。将产GSH富硒益生菌溶于生理盐水后每天灌胃大鼠。其中，C组和E组中大鼠每天GSH摄入量分别为34.1 mg/kg体重。C组和E组中大鼠每天有机硒摄入量为38.4μg/kg体重。C组和E组中大鼠每天摄入的酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌活菌数分别约为1×1010CFU和1×1012 CFU。实验结果表明，SGP可显著改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。EX-527可明显降低SGP对肝纤维化大鼠的保护作用。这保护作用的主要机理为:SGP可通过激活SIRT1信号通路来降低肝内氧化应激水平，炎症，MAPK的信号通路的激活和内质网应激水平从而保护CCl4诱导的大鼠肝纤维化。

目录

论文说明

声明

摘要

符号和缩略语

前言

第一章 GSH和肝病的关系的研究概述

1 GSH结构

2 GSH的生理功能

3 GSH的生物合成

4 GSH的生产方法

4．1 萃取法

4．2 酶法

4．3 发酵法

5 GSH在肝脏疾病中的应用

5．1 治疗酒精性肝炎

5．2 治疗病毒性肝炎

5．3 治疗药物性肝炎

6 GSH的市场前景和国内外需求

参考文献

第二章 硒和肝病的关系的研究概述

1 硒的理化性质及其在自然界中的分布

1．1 硒的理化性质

1．2 硒在自然界中的分布

2 硒在动物体内的分布及代谢

2．1 硒在动物体内的分布

2．2 硒在动物体内的代谢

3 硒的生物学功能

4 硒和肝病的关系

4．1 硒与急慢性肝炎

4．2 硒与肝纤维化和肝硬化

4．3 硒与肝癌

5 不同形式硒化合物对肝病的作用

参考文献

第三章 益生菌和肝病的关系的研究概述

1 益生菌的简介

2 益生菌的分类

3 益生菌的特性

4 益生菌的作用

4．1 益生菌调节胃肠道微生态平衡的作用

4．2 益生菌保护肝脏的作用

4．3 益生菌保护心血管的作用

4．4 益生菌的免疫调节作用

4．5 益生菌的营养作用

4．6 益生菌的抗氧化作用

4．7 益生菌的其他生理功能

参考文献

第四章 一株高产GSH酵母菌的分离鉴定

1 材料及方法

1．1 主要试剂及器材

1．2 酵母菌分离源

1．3 培养基

1．4 蜂蜜中酵母菌株的分离

1．5 酵母菌的产GSH试验

1．6 酵母菌体干重及活菌数的测定

1．7 菌株的鉴定

1．8 种子液的制备

1．9 酵母细胞中GSH含量的检测

1．10 统计

2 结果分析

2．1 酵母菌的分离

2．2 筛选结果

2．3 鉴定结果

3 讨论

参考文献

第五章 产GSH富硒益生菌的研制

1 材料及方法

1．1 主要试剂及器材

1．2 试验菌种

1．3 培养基

1．4 酵母菌体干重及活菌数的测定

1．5 优化制备

1．6 GSH含量的检测

1．7 硒含量的测定检测

1．8 统计

2 结果分析

2．1 发酵培养基成分的优化

2．2 接种量和发酵时间对GSH产量和DCW的影响

2．3 发酵罐中生产GSH工艺条件的优化

2．4 L．acidophilus的接种量对GSH产量和DCW的影响

2．5 不同浓度的Na2SeO3添加量对GSH产量和DCW的影响

3 讨论

参考文献

第六章 不同剂量的产GSH富硒益生菌对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的影响

1 材料及方法

1．1 主要试剂及器材

1．2 产GSH富硒益生菌

1．3 试验动物和试验设计

1．4 血清生化指标的检测

1．5 组织学检测

1．6 肝内羟脯氨酸含量的测定

1．7 Western blot检测蛋白水平

1．8 Real-time PCR检测基因mRNA水平

1．9 统计分析

2 结果与分析

2．1 SGP对肝纤维化大鼠血清ALT和AST水平的影响

2．2 SGP对肝纤维化大鼠肝组织病理学变化的影响

2．3 SGP对肝纤维化大鼠肝内胶原蛋白沉积的影响

2．4 SGP对肝纤维化大鼠肝内星状细胞激活的影响

2．5 SGP对肝纤维化大鼠肝内羟脯氨酸含量的影响

2．6 SGP对肝纤维化大鼠肝内纤维化相关基因表达的影响

3 讨论

参考文献

第七章 三种益生菌对CCl4诱导的大鼠纤维化的影响的比较

1 材料及方法

1．1 主要试剂及器材

1．1 富硒益生菌和益生菌

1．2 富硒益生菌，益生菌和亚硒酸钠日粮

1．3 产GSH富硒益生菌，富硒益生菌和产GSH益生菌

1．3 试验动物和试验设计

1．4 血清生化指标的检测

1．5 组织学检测

1．6 肝内羟脯氨酸含量的测定

1．7 Western blot检测蛋白水平

1．8 Real-time PCR检测基因mRNA水平

1．9 肝内抗氧化能力的测定

1．10 统计分析

2 结果与分析

2．1 SP对肝纤维化大鼠的保护作用

2．2 SGP，SP和GP对肝纤维化大鼠的保护作用的比较

2．3 SGP，SP和GP对肝纤维化大鼠肝内氧化应激影响的比较

2．4 SGP，SP和GP对肝纤维化大鼠肝内炎症影响的比较

2．5 SGP，SP和GP对肝纤维化大鼠肝内MAPK信号通路影响的比较

2．6 SGP，SP和GP对肝纤维化大鼠肝内内质网应激影响的比较

3 讨论

参考文献

第八章 产GSH富硒益生菌通过激活SIRT1信号通路来降低大鼠的肝纤维化

1 材料及方法

1．1 主要试剂及器材

1．2 产GSH富硒益生菌

1．3 试验动物和试验设计

1．4 血清生化指标的检测

1．5 组织学检测

1．6 肝内羟脯氨酸含量的测定

1．7 Western blot检测蛋白水平

1．8 Real-time PCR检测基因mRNA水平

1．9 肝内抗氧化能力的测定

1．10 统计分析

2 结果与分析

2．1 EX527可减弱SGP对肝纤维化大鼠的保护作用

2．2 EX527可减弱SGP对肝纤维化大鼠肝内氧化应激的降低作用

2．3 EX527可减弱SGP对肝纤维化大鼠肝内炎症的降低作用

2．4 EX527可减弱SGP对肝纤维化大鼠肝内MAPK信号通路激活的降低作用

2．5 EX527可减弱SGP对肝纤维化大鼠肝内内质网应激的降低作用

3 讨论

参考文献

全文结论

论文创新点

攻读博士学位期间发表的学术性论文及著作

致谢